含洛匹那韋/利托那韋二線方案抗HIV病毒治療失敗基因型耐藥情況分析

劉家法，張 米，李健健，楊壁琿，鄧雪媚，雷素云

(云南省傳染病?？漆t(yī)院/艾滋病關(guān)愛中心，昆明 650301)

云南省是我國人類免疫缺陷病毒(HIV)/艾滋病(AIDS)的傳播、流行和危害最為嚴(yán)重的地區(qū)之一，目前治療人數(shù)較多，基因型較為復(fù)雜，已成為云南省的重大公共衛(wèi)生問題和社會(huì)問題之一，引起社會(huì)各界的高度重視。據(jù)云南省防治艾滋病局的報(bào)道，截至2016 年12 月，全省存活HIV感染者92 957例，累計(jì)治療患者88 549例，正在治療70 317例，其中因耐藥發(fā)生治療失敗總?cè)藬?shù)9 344例，累計(jì)治療總?cè)藬?shù)中耐藥發(fā)生率為10.55%。對于治療失敗的患者不得不更換治療方案，使用二線治療方案，提高治療效果。本文對云南省更換含洛匹那韋/利托那韋(LPV/r)二線抗病毒治療方案治療失敗的患者進(jìn)行基因型耐藥檢測，以便了解目前云南省二線治療方案的耐藥情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月1日至2016年12月31日來自云南省傳染病?？漆t(yī)院接受免費(fèi)抗病毒治療的患者治療信息，篩選出更換含LPV/r治療方案且治療時(shí)間大于6個(gè)月、檢測病毒載量大于1 000 copy/mL的血漿標(biāo)本共計(jì)162份。同時(shí)收集這部分患者的人口學(xué)、臨床及實(shí)驗(yàn)室資料。

1.2 方法

1.2.1HIV-1病毒載量檢測 參照《HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南》(2013版)。采用羅氏公司的HIV病毒載量檢測儀，以及其配套試劑COBAS TaqMan HIV-1 Test v2.0定量檢測HIV-1病毒載量，具體檢測方法參見儀器說明書及試劑盒說明書。

1.2.2血漿RNA提取 采用美國雅培公司m2000sp全自動(dòng)核酸提取儀及配套試劑從待檢血漿中提取病毒RNA，具體提取方法參見儀器說明書及試劑盒說明書。

1.2.3基因型耐藥性檢測 采用自建基因型耐藥檢測方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，并參照《HIV-1基因型耐藥檢測及質(zhì)量保證指南》(2013版)，通過套式聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增覆蓋蛋白酶基因全序列和反轉(zhuǎn)錄酶1～300位密碼子序列，擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因有限公司進(jìn)行純化和序列測定。擴(kuò)增及測序引物參照文獻(xiàn)[1]。

1.2.4序列拼接與分析 耐藥分析應(yīng)用Contig Express 軟件拼接原始核苷酸序列，用BioEdit 軟件對拼接后的序列校對、整理和比對分析，整理后序列提交美國斯坦福大學(xué)HIV耐藥基因型檢測數(shù)據(jù)分析和解釋系統(tǒng)(http://hivdb.stanford.edu)進(jìn)行耐藥突變位點(diǎn)的分析和解釋耐藥變異情況。

2 結(jié) 果

2.1 人口學(xué)特征

篩選云南省抗病毒治療數(shù)據(jù)庫，篩選出符合條件樣本162份,其病毒載量均值為40 951 copy/mL,CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均值為249個(gè)/μL，平均治療時(shí)間為42.3個(gè)月。這部分患者中男96例，女66例，男女比率為1.45∶1.00；年齡4～81歲，平均年齡為43歲?；颊呔唧w信息見表1。

2.2 耐藥基因擴(kuò)增和測序結(jié)果

162例樣本經(jīng)自建基因型耐藥檢測方法RT-PCR擴(kuò)增陽性，將擴(kuò)增出來的片段進(jìn)行基因序列測序，共獲得162份完整基因序列。

2.3 耐藥情況

以出現(xiàn)任意1種藥物耐藥突變(低、中、高度耐藥)統(tǒng)計(jì)為耐藥，將162例完整基因序列，上傳美國斯坦福大學(xué)HIV-1耐藥基因型檢測數(shù)據(jù)分析和解釋系統(tǒng)結(jié)果顯示，65(40.1%)例對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)以蛋白酶抑制劑 (PIs)有不同程度耐藥；其中對NRTIs和NNRTIs的耐藥分別有34例(21.0%)和54例(33.3%)，對PIs耐藥5例(3.1%)。在已檢出具有不同程度耐藥的65例患者中，有3例(1.9%)出現(xiàn)對3類藥同時(shí)耐藥的患者；有28例(17.3%)的患者對NRTIs及NNRTIs兩種藥物同時(shí)出現(xiàn)耐藥。在使用過的藥物中，對NVP、EFV、3TC、FTC高度耐藥的情況分別是45例(27.8%)、35例(21.6%)、26例(16.0%)、26例(16.0%)，對PIs有2例患者出現(xiàn)高度耐藥的情況。具體對每種藥物的耐藥情況見表2。

表1 162例患者的臨床資料

EFV：依非韋倫；NVP：奈韋拉平；3TC：拉米夫定；AZT：齊多夫定；D4T：司他夫定；TDF：替諾福韋；ABC：阿巴卡韋

表2 3類藥物的耐藥數(shù)量及耐藥水平

P：代表潛在耐藥；L：低度耐藥；I：代表中度耐藥；H：高度耐藥

2.4 基因型耐藥突變位點(diǎn)情況

162例患者的檢測結(jié)果中，與PIs相關(guān)的主要耐藥基因突變位點(diǎn)有M46I、V82A、L76V、I84V和I54V各1例。與NRTIs相關(guān)的突變中，突變位點(diǎn)發(fā)生頻率前3位的是M184V/I、T69N/D和K70R,分別為16.0%(26/162)、8.0%(13/162)和4.3%(7/162)。與NNRTIs的突變中，突變位點(diǎn)發(fā)生頻率前3位的是K103N/E、V179D/E/T和V90I,分別為15.4%(25/162)、14.2%(23/162)和8.6%(14/162)。具體耐藥位點(diǎn)情況見表3。

表3 常見耐藥突變類型及比例

續(xù)表3 常見耐藥突變類型及比例

2.5 基因型耐藥突變位點(diǎn)情況

不同感染方式中的基因型分布見表4。

表4 不同感染方式中HIV-1基因型分布[n(%)]

表5 針對不同治療方案耐藥發(fā)生情況及耐藥比例

2.6 不同抗病毒治療方案耐藥發(fā)生情況

對不同治療方案的耐藥情況見表5。

3 討 論

為了有效控制AIDs疫情的蔓延，我國從2002年開始試行AIDs免費(fèi)抗病毒治療項(xiàng)目，自2003年起全面開展落實(shí)國家“四免一關(guān)懷”政策[2-3]。經(jīng)過10多年來各級政府逐步落實(shí)AIDs患者免費(fèi)抗病毒治療的政策，建立起了免費(fèi)AIDs抗病毒治療的各級保障機(jī)制，符合治療標(biāo)準(zhǔn)且接受抗病毒治療的患者比例逐年增多。隨著抗病毒治療時(shí)間延長，治療失敗的患者逐年增多。對于治療失敗的患者，需要選擇更換為二線治療方案。在我國，主要的二線治療方案為兩種NRTIs加一種PI共同治療[4]。目前國內(nèi)免費(fèi)使用的PIs主要是LPV/r，對于更換含LPV/r二線治療方案治療失敗的患者，將面臨無免費(fèi)抗病毒藥可用的情況。

HIV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，病毒在復(fù)制過程中伴隨著高度變異性。經(jīng)過長時(shí)間的治療，在抗病毒藥物的選擇壓力下，HIV基因易發(fā)生突變而對多種藥物的產(chǎn)生耐藥[5]。在本研究中，65(40.1%)例對NRTIs、NNRTIs和PIs有不同程度耐藥；其中對NRTIs和NNRTIs的耐藥分別有34例(21.0%)和54例(33.3%)，對PIs耐藥5例(3.1%)。在已檢出具有不同程度耐藥的65例患者中，有3例(1.9%)出現(xiàn)對3類藥同時(shí)耐藥的患者；有28例(17.3%)的患者對NRTIs及NNRTIs兩類藥物同時(shí)出現(xiàn)耐藥。云南省2012年所有治療失敗人群的耐藥率為58.9%[1]，2008-2012年所有治療失敗人群的耐藥率為53.8%[6]，本研究耐藥率低于之前的研究。究其原因一方面是這些更換二線治療方案的患者可能僅有少數(shù)是因?yàn)槟退幐鼡Q治療方案，還有一部分是因?yàn)槊庖咧亟ú涣?、藥物不良反?yīng)及懷孕等原因更換，其患者對藥物本身并不耐藥。另一方面可能是由于PIs比NNRTIs有更高的耐藥屏障，不易產(chǎn)生耐藥。

在使用過的藥物中，耐藥率較高的幾種藥仍然是NVP、EFV、3TC、FTC，耐藥率低于其他研究[1,6-7]。對PIs有5例患者出現(xiàn)耐藥的情況，其中2例患者對LPV/r產(chǎn)生高水平耐藥。本次研究中有3例患者對PIs、NRTIs和NNRTIs這3類藥均出現(xiàn)耐藥，這3例患者均是通過性傳播方式感染的男性患者，出現(xiàn)多重耐藥的原因可能跟性傳播導(dǎo)致交叉感染有關(guān)。本研究中，PIs的主要突變位點(diǎn)M46I、I54V、L76V、I84V和V82A各出現(xiàn)1次。M46I為輔助突變，當(dāng)與其他PIs突變同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，可降低PIs敏感性；I54V與其他PIs突變同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，會(huì)增加PIs的耐藥性；V82A是PIs較常出現(xiàn)的耐藥突變，通常在PIs治療失敗早期出現(xiàn)；I84V常出現(xiàn)在PIs持續(xù)治療無效時(shí)，可使全部PIs的敏感性降低[8]。在本研究中與NRTIs和NNRTIs相關(guān)的耐藥突變中，排名前3位的耐藥突變分別是M184、T69、K70和K103、V179、V90，這與云南省楊紹敏等[6]的研究結(jié)果不一致。其主要原因一方面是云南省處于邊境地區(qū)，人員流動(dòng)性大，導(dǎo)致HIV毒株在不停地變化，重組毒株在不斷增加，而耐藥突變與HIV-1基因亞型相關(guān)[9]，導(dǎo)致耐藥位點(diǎn)也在不停地變化。另一方面是本次研究的患者都是先使用一線治療方案后再改為含LPV/r的二線治療方案，在不同的藥物作用下，導(dǎo)致耐藥位點(diǎn)發(fā)生改變。

在更換的二線治療方案中，主要使用的是3TC+TDF+LPV/r和3TC+AZT+LPV/r兩種治療方案，兩種方案的耐藥率分別為35.5%(36/102)和21.4%(12/56)，使用3TC+TDF+LPV/r的耐藥率高于使用3TC+AZT+LPV/r方案的患者，其主要原因可能為TDF易出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)和腎毒性[10]，從而影響藥物的吸收有關(guān)。

隨著抗病毒治療時(shí)間的延長，因?yàn)橐痪€藥物耐藥屏障低，同時(shí)不良反應(yīng)大，在藥物壓力作用下治療失敗的患者會(huì)越來越多，未來會(huì)有更多的患者使用二線治療方案，而我國目前可供免費(fèi)使用的二線藥物有限。因此，在治療過程中應(yīng)加強(qiáng)對患者依從性教育，同時(shí)加強(qiáng)監(jiān)測檢測，減少對二線藥物耐藥的產(chǎn)生，同時(shí)減少耐藥毒株的傳播，是以后抗病毒治療的重點(diǎn)工作。