宋瑞雯，張麗萍，陳穎，徐磊

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

抑郁癥是一種以情緒持續(xù)低落為主要癥狀的身心疾病，因其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確、發(fā)病率逐年上升及高致殘致死率已成為國際精神醫(yī)學(xué)界亟待解決的難題。研究表明：慢性、低強(qiáng)度且長期的應(yīng)激性生活事件不僅是誘發(fā)抑郁癥的重要原因[1]，還能導(dǎo)致一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的改變。已有研究表明，下丘腦與情緒反應(yīng)的關(guān)系密切相關(guān)，但目前相關(guān)研究多集中在應(yīng)激后大鼠額前皮質(zhì)區(qū)和海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性方面，尚未見對慢性應(yīng)激后大鼠下丘腦神經(jīng)元超微變化的研究[2-3]。課題組前期臨床療效觀察證實(shí)，加味溫膽湯對抑郁癥患者情緒低落、睡眠障礙、食欲不振等癥狀具有良好療效，且胃腸道不適等副作用顯著低于西藥氟西汀[4-5]；前期機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，本方可改善抑郁模型大鼠海馬CA3區(qū)超微神經(jīng)元結(jié)構(gòu)萎縮[3]。本研究在前期臨床療效、作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析加味溫膽湯對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠下丘腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化的影響，以期進(jìn)一步闡釋加味溫膽湯抗抑郁的病理形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級SD大鼠，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)合格證號 SCXK(軍)2014-4401。

1.2 藥物及試劑

加味溫膽湯由竹茹、半夏、枳實(shí)、陳皮、遠(yuǎn)志、合歡花、茯苓和郁金等藥物組成，均購買于天津同仁堂藥店，經(jīng)傳統(tǒng)水煎法制備濃縮浸膏；鹽酸氟西汀片(美國禮來公司，20 mg/粒) ，使用前雙蒸水配制成藥液。

1.3 儀器及試劑

自制曠場實(shí)驗(yàn)箱，日本日立H-7500透射電子顯微鏡，徠卡UC-7超薄切片機(jī)，德國 EPPENDORF移液器。3%多聚甲醛、4℃預(yù)冷1%戊二醛，37℃預(yù)熱0.9%生理鹽水，10%水合氯醛、4%戊二醛、輸液器由賽東南試劑公司提供。1/15M磷酸緩沖液、1%四氧化鋨、丙酮、包埋液、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛由河北醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

參照隨機(jī)數(shù)字表法將32只SD大鼠隨機(jī)分為4組：空白組、模型組、氟西汀組(簡稱西藥組)和加味溫膽湯組(簡稱中藥組)?？瞻捉M每日正常進(jìn)水、進(jìn)食，每籠8只；其余3組1只/籠，連續(xù)造模3周后，模型組灌胃給予生理鹽水2 mL/(kg·d)，西藥組灌胃給予氟西汀溶液1.8 mg/(kg·d)，中藥組灌胃給予加味溫膽湯煎劑12 g/(kg·d)，每日早晨8：00開始，持續(xù)給藥4周。

2.2 動(dòng)物模型制備

除正常組外，其余各組持續(xù)3周接受9種未預(yù)知的應(yīng)激刺激，分別是：24 h禁食，24 h禁水，夾尾1 min，懸尾1 min，通宵照明，45℃烘箱熱烘5 min，4℃冷水游泳5 min，高速水平振蕩鼠箱3 min，100伏交流電電擊足底1 min。3周內(nèi)逐日隨機(jī)給予1～2種刺激，期間每種刺激方式出現(xiàn)不少于2～3次，但同一種刺激不可持續(xù)出現(xiàn)，使動(dòng)物不能預(yù)知每日即將給予的刺激方式。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 體質(zhì)量變化

造模前、造模3周及給藥4周后分別稱取大鼠體質(zhì)量，計(jì)算各組大鼠的體質(zhì)量增長數(shù)(△W)，比較各組大鼠體質(zhì)量變化趨勢。

△W1=W(造模3周后體質(zhì)量)-W(造模前體質(zhì)量)

△W2=W(給藥4周后體質(zhì)量)-W(造模3周后體質(zhì)量)

2.3.2 曠場試驗(yàn)

以大鼠四爪均進(jìn)入方格內(nèi)穿越曠場試驗(yàn)箱底面格子數(shù)計(jì)為水平活動(dòng)得分；以大鼠兩前爪騰空或攀爬于墻壁使全身直立記為垂直活動(dòng)得分，兩者總和為曠場試驗(yàn)得分。分別測定各組大鼠造模前、造模3周后及給藥4周后水平活動(dòng)得分和垂直活動(dòng)得分，計(jì)算各組大鼠曠場試驗(yàn)總分，3 min/次，比較各組大鼠曠場試驗(yàn)變化趨勢。

2.3.3 透射電鏡

糖水實(shí)驗(yàn)、曠場試驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)選取4只大鼠，腹腔麻醉大鼠，心臟灌注內(nèi)固定液，取2～3塊大小為1 mm×1 mm×1 mm的下丘腦組織標(biāo)本，4%戊二醛固定至少2 h，1%四氧化鋨后固定2 h，梯度丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，烤箱60℃固化48 h，超薄切片機(jī)將下丘腦樣品切成厚約50 nm的切片，醋酸雙氧鈾浸泡45 min，檸檬酸鉛浸泡30 min，進(jìn)行電子染色。置于透射電鏡下觀察下丘腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化，包括細(xì)胞核、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量變化情況

造模3周后：與空白組比較，模型組、西藥組和中藥組體質(zhì)量增長數(shù)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；模型、西藥、中藥組之間對照，體質(zhì)量增長數(shù)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

給藥4周后：與空白組比較，模型組體質(zhì)量增長數(shù)減少有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與模型組對照，西藥組和中藥組體質(zhì)量增長數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；西藥組和中藥組組間相對比，體質(zhì)量增長數(shù)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量增長數(shù)結(jié)果比較

注：與空白組比較，△P<0.01；模型組比較，▲P<0.01，▲▲P<0.05

3.2 曠場試驗(yàn)

造模3周后：與空白組相比，模型組、西藥組和中藥組中藥組曠場試驗(yàn)得分有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；模型組、中藥組和西藥組3組之間曠場試驗(yàn)得分無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

給藥4周后：模型組與空白組相比，曠場試驗(yàn)得分有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；中、西藥組之間對比，曠場試驗(yàn)得分無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，中藥組和西藥組曠場試驗(yàn)得分有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠曠場試驗(yàn)運(yùn)動(dòng)得分比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

3.3 電鏡觀察結(jié)果

正常組大鼠神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)基本完整，嵴排列規(guī)則，基質(zhì)密度正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，膜表面分布大量核糖體。模型組：電鏡下超微形態(tài)變異較明顯，細(xì)胞體腫脹變性，線粒體存在不同水平的腫脹、線粒體膜、嵴產(chǎn)生溶解和斷裂現(xiàn)象，線?；|(zhì)分布不勻、電子密度下降，嚴(yán)重者呈現(xiàn)融合消散征象；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量減少，并出現(xiàn)不規(guī)則擴(kuò)張、折疊、斷裂、盤曲、細(xì)胞空化，膜結(jié)構(gòu)明顯破損。中藥組和西藥組下丘腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)接近正常狀態(tài)，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)增加程度較輕，核邊緣光滑，核周間隙較為正常；較少數(shù)線粒體形態(tài)輕度腫脹，基質(zhì)分布較均勻，電子密度略增加；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體正常，與模型組比，神經(jīng)元受損程度明顯減輕。如圖1。

圖1 電鏡下各組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)

4 討論

目前，已有較多的國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)系統(tǒng)可塑性變化與應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，且以往文獻(xiàn)對應(yīng)激后中樞神經(jīng)可塑性變化的研究大多集中在大鼠海馬與額前皮質(zhì)兩部位，電鏡下觀察可見：大鼠接受應(yīng)激刺激后，額前皮質(zhì)區(qū)突觸前膜的突觸囊泡密度和突觸后膜的致密物厚度均會(huì)降低，出現(xiàn)異常的突觸超微形態(tài)結(jié)構(gòu)[2]；慢性應(yīng)激性抑郁可導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性發(fā)生改變[3-4]，證實(shí)了慢性應(yīng)激的確可以造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生可塑性變化。下丘腦作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)的高級中樞，下丘腦可塑性與應(yīng)激的關(guān)系也已得到了的證明：光鏡下，與對照組比較，慢性應(yīng)激大鼠下丘腦神經(jīng)細(xì)胞間隙減少，空泡減少，排列略紊亂，細(xì)胞質(zhì)染色加深，核增大、色深[6]?？梢姡詰?yīng)激使大鼠下丘腦一般結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但其超微結(jié)構(gòu)變化相關(guān)研究尚未見報(bào)道，嚴(yán)重制約了深入研究下丘腦神經(jīng)可塑性在抑郁癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討中藥復(fù)方加味溫膽湯對慢性應(yīng)激模型大鼠下丘腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響。行為學(xué)表明：造模3周后，與正常組對照，體質(zhì)量增長數(shù)和曠場試驗(yàn)得分上，模型、西藥和中藥組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，而模型、西藥和中藥組之間得分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說明抑郁模型制備成功；給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量增長數(shù)、曠場實(shí)驗(yàn)得分顯著下降(P<0.01)，與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠體質(zhì)量增長數(shù)、曠場實(shí)驗(yàn)得分顯著增加(P<0.01)。透射電鏡結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠電鏡下下丘腦神經(jīng)元嚴(yán)重受損，超微形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變；與模型組比較，中藥組和西藥組的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雖然受損，但下丘腦神經(jīng)元受損程度總體比模型組顯著減輕，說明慢性應(yīng)激可以導(dǎo)致大鼠下丘腦組織線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原顆粒的損傷，使部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡改變，這從形態(tài)學(xué)上證明了慢性應(yīng)激可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)下丘腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變，加味溫膽湯可能是通過減輕抑郁模型大鼠下丘腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損害而改善抑郁樣行為。