小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相GC-MS分析及其化感作用研究

李曉霞 沈奕德 劉延 王亞 陳頌梅 張敏 范志偉

摘要：以海南省近年來(lái)突發(fā)的外來(lái)入侵植物小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)[Asystasia gangetica subsp. micrantha （Nees） Ensermu]為研究對(duì)象，采用氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對(duì)小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)地上部分石油醚萃取相進(jìn)行化學(xué)成分分析，并采用不同質(zhì)量濃度（0.012 5、0.025、0.05 g/mL）的小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)地上部分石油醚萃取相對(duì)三葉鬼針草（Bidens pilosa var. radiate Sch. Bip.）和假臭草[Praxelis clematidea （Griseb.） R. M. King et H. Rob.]進(jìn)行培養(yǎng)皿濾紙法的化感作用測(cè)定。結(jié)果表明，小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相共鑒定出29種化合物，占總量的97.917%，以醇類為主，占總量的51.384%，其次為脂類（18.372%），再次為烯烴類（16.264%），此外還有酚、醛、酸等。生物測(cè)定結(jié)果表明，小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)伴生種三葉鬼針草和假臭草的種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)均產(chǎn)生化感抑制作用，其中普遍發(fā)現(xiàn)對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)于對(duì)莖長(zhǎng)的抑制作用。以上結(jié)果說(shuō)明，小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)通過(guò)釋放化感物質(zhì)，可起到抑制鄰近植物生長(zhǎng)的作用，提高其入侵力。

關(guān)鍵詞：小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò);地上部分石油醚萃取相;GC-MS;化感作用

中圖分類號(hào)： R284.1;Q949.778.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0168-04

收稿日期：2018-08-13

基金項(xiàng)目：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（編號(hào)：2018hzs1J005、2016hzs1J019）。

作者簡(jiǎn)介：李曉霞（1983—），女，云南大理人，助理研究員，主要從事熱帶農(nóng)林雜草生物學(xué)、生態(tài)學(xué)與綜合監(jiān)控技術(shù)研究。E-mail：lixiaoxiayn@163.com。

通信作者：范志偉，博士，研究員，主要從事入侵植物與雜草生物學(xué)、生態(tài)學(xué)與綜合監(jiān)控技術(shù)研究。E-mail：fanweed@163.com。

外來(lái)入侵植物嚴(yán)重威脅本地生態(tài)系統(tǒng)，生物多樣性平衡已成為世界各國(guó)的生態(tài)問(wèn)題，甚至給社會(huì)經(jīng)濟(jì)和自然環(huán)境造成了巨大的沖擊[1]。關(guān)于外來(lái)入侵植物的成災(zāi)機(jī)制一直是農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)關(guān)注的問(wèn)題。目前，在多種入侵植物的研究中已發(fā)現(xiàn)化感作用的入侵機(jī)制?；凶饔檬侵参镌谏L(zhǎng)過(guò)程中，通過(guò)淋溶、根系分泌、揮發(fā)、植物殘?bào)w分解4種途徑向環(huán)境中釋放化感物質(zhì)并對(duì)其他植物或微生物產(chǎn)生直接或間接的有利或有害的作用[2]。隨著對(duì)入侵植物的研究的深入，發(fā)現(xiàn)多數(shù)入侵植物通過(guò)分泌化感物質(zhì)，提高自身適應(yīng)環(huán)境、生存與競(jìng)爭(zhēng)的能力，從而形成單優(yōu)勢(shì)入侵種群，因此，認(rèn)為化感作用是入侵植物的一種“新型”化學(xué)武器[3-6]。研究證實(shí)，許多入侵植物在其入侵新生境的過(guò)程中通過(guò)釋放化學(xué)物質(zhì)抑制植物的種子萌發(fā)和生長(zhǎng)，如薇甘菊[7]、紫莖澤蘭[8-9]、飛機(jī)草[10]、香茅[11]等。因此，開(kāi)展植物化感作用研究對(duì)于入侵植物替代控制[12]、農(nóng)田雜草防除[11]、開(kāi)發(fā)植物源除草劑[13]等具有重要意義。

小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)[Asystasia gangetica subsp. micrantha （Nees） Ensermu]是爵床科十萬(wàn)錯(cuò)屬多年生草本植物，原產(chǎn)于非洲、印度和斯里蘭卡，現(xiàn)已成為中國(guó)臺(tái)灣、馬來(lái)西亞、澳大利亞、印度尼西亞、太平洋島嶼等地區(qū)的重要入侵物種[14-16]。小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)最早于2005年在海南儋州被發(fā)現(xiàn)，據(jù)筆者所在研究團(tuán)隊(duì)多年的觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，該植物已迅速演變成為海南西北部地區(qū)的重要外來(lái)入侵植物，已經(jīng)對(duì)入侵區(qū)域的農(nóng)牧業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)與管理帶來(lái)了嚴(yán)重的影響。因此，關(guān)于小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)如何入侵及如何迅速占據(jù)強(qiáng)大生境等的研究已經(jīng)成為當(dāng)下重要的課題。從其強(qiáng)大的競(jìng)爭(zhēng)力和生長(zhǎng)特性來(lái)看，很有可能含有抑制其他植物生長(zhǎng)的化感物質(zhì)。然而，目前關(guān)于小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)化感作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。為驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究通過(guò)乙醇提取、石油醚萃取小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)地上部分脂溶性成分，并對(duì)其所含的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析，通過(guò)室內(nèi)生物測(cè)定法測(cè)定了其對(duì)伴生種三葉鬼針草（Bidens pilosa var. radiate Sch. Bip.）和假臭草[Praxelis clematidea （Griseb.） R. M. King et H. Rob.]的化感作用，旨為闡明化感作用在入侵植物小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)對(duì)入侵地鄰近植物的化感抑制作用，為進(jìn)一步揭示其入侵的化學(xué)機(jī)制并制定合理的治理方法提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)地上部分于2018年5月中旬采自海南省中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州細(xì)胞樓實(shí)驗(yàn)基地。受試材料三葉鬼針草、假臭草采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州科技園區(qū)。

1.2方法

1.2.1小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)地上部分石油醚萃取相化學(xué)成分的提取取自然風(fēng)干的小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)地上部分2.5 kg，切成小塊;在室溫下，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇進(jìn)行3次回流提取;合并提取物后減壓濃縮得粗浸膏，將粗浸膏溶解于水后用石油醚萃取，得到小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相。

1.2.2小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)萃取相化學(xué)成分分析取小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相，用三氯甲烷稀釋后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）測(cè)定。氣相條件：色譜柱為FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫為46 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升溫至310 ℃，保持12 min。運(yùn)行時(shí)間為58 min;汽化室溫度為250 ℃;載氣為高純He（99.999%），載氣流量為1.0 mL/min;柱前壓為7.06 psi;分流進(jìn)樣，分流比為20 ∶1;溶劑延遲時(shí)間為5 min。質(zhì)譜條件：離子源為EI（非選擇性電離）源;質(zhì)量范圍為29～500 amu;離子源溫度為230 ℃;四極桿溫度為150 ℃;接口溫度為280 ℃;電子能量為70 eV;發(fā)射電流為34.6 μA;倍增器電壓為1 612 V。對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist 2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖。

1.2.3種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)將直徑為9 cm的培養(yǎng)皿洗凈、烘干、滅菌，鋪2層滅菌定性濾紙，分別加入濃度為0.05、0.025、0.012 5 g/mL的小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相水溶液5 mL，以蒸餾水為對(duì)照，設(shè)3個(gè)重復(fù)。待濾紙浸濕后將飽滿、大小均勻并催芽后的三葉鬼針草和假臭草種子各20粒放入培養(yǎng)皿中，置于人工氣候箱[濕度70%，溫度（25±2） ℃，光照時(shí)間14 h/d，光照度16 000 lx）]中恒溫培養(yǎng)。種子出現(xiàn)萌芽（胚根長(zhǎng)度≥1 mm）后開(kāi)始記錄每天種子的萌發(fā)數(shù)量，7 d后統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽率并測(cè)量根長(zhǎng)及莖長(zhǎng)。

2結(jié)果與分析

2.1小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相主要化學(xué)成分

經(jīng)GC-MS分析，共鑒定出29種化合物，占總量的97.917%，用峰面積歸一化法測(cè)定小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（圖1和表1）。結(jié)果顯示，小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相化學(xué)成分以醇類為主，占總量的51.384%，含量較高的成分依次為豆甾醇（15.578%）、穿貝海綿甾醇（13.987%）、反式植醇（11.653%）、二氫布拉西唑醇（7.142%）等;其次為酯類（18.372%），含量較高的成分分別為亞麻酸乙酯、棕櫚酸乙酯等;再次為烯烴類（16.264%）;此外還有酚、醛、酸等。

2.2小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)伴生種種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1對(duì)伴生種種子萌發(fā)的影響不同濃度下小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)三葉鬼針草、假臭草2種伴生種種子萌發(fā)都有明顯的抑制作用（圖2），隨著濃度的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)，但在相同濃度下2種伴生種的種子萌發(fā)率差異不顯著。以上結(jié)果說(shuō)明，小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相具有抑制伴生種種子萌發(fā)的化感活性物質(zhì)，且化感活性物質(zhì)的化感作用隨著濃度升高逐漸增強(qiáng)。

2.2.2對(duì)伴生種三葉鬼針草、假臭草幼苗生長(zhǎng)的影響在濃度為0.012 5、0.025 g/mL條件下小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)伴生種三葉鬼針草根長(zhǎng)的化感抑制作用大于對(duì)莖長(zhǎng)的化感抑制作用，但隨著濃度升高，對(duì)根長(zhǎng)的化感抑制作用差異不顯著（圖3）。在不同濃度下小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)假臭草根長(zhǎng)的抑制作用差異顯著，表現(xiàn)為隨著濃度升高，化感作用逐漸增強(qiáng)（0.012 5、0.025、0.05 g/mL濃度下化感效應(yīng)敏感指數(shù)分別為-59.096%、-77.933%、-94.421 5%）;對(duì)莖長(zhǎng)的作用表現(xiàn)為在濃度為0.05 g/mL下假臭草的莖長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組，但與0.012 5、0.025 g/mL差異不顯著（圖3）。

以上結(jié)果說(shuō)明：小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)三葉鬼針草、假臭草幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的化感抑制作用，且對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用大于對(duì)莖長(zhǎng)的抑制作用，但總體上來(lái)說(shuō)，隨著濃度升高抑制作用逐漸增強(qiáng)。

3討論

化感作用是研究入侵植物入侵機(jī)制的重要途徑，多年來(lái)一直是研究熱點(diǎn)。已有研究結(jié)果表明，化感物質(zhì)作為次生代謝物可通過(guò)化感作用影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育（如種子的萌發(fā)、幼苗的生長(zhǎng)、成株的開(kāi)花結(jié)實(shí)等），從而提高植物種群在生存競(jìng)爭(zhēng)中的優(yōu)勢(shì)地位，利于種群的擴(kuò)大和繁衍[17]。植物中化感物質(zhì)主要分為水溶性直鏈醇、有機(jī)酸、脂肪族醛和酮、簡(jiǎn)單不飽和內(nèi)酯、長(zhǎng)鏈脂肪酸和多炔、醌類、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物等14類[2]。不同化感物質(zhì)的化感作用也并不相同。水溶性有機(jī)酸、直鏈醇、脂肪族醛和酮大都能抑制種子的萌發(fā)[18-19];從豚草（Ambrosia artemisiifolia）、三裂葉豚草（Ambrosia trifida）和毛果破布草（Ambrosia psilostachya）中分離到的揮發(fā)性萜類具有降低大豆、洋蔥、燕麥、玉米和小麥種子發(fā)芽率并延遲發(fā)芽的作用[20]。而從菊科植物中分離到的酚類、有機(jī)酸類等化感物質(zhì)可影響被感植物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收及干擾參與光合途徑的多種酶活性[21]。也有研究表明，從細(xì)葉亞菊中分離到的松柏醇能抑制垂穗披堿草（Elymus nutans Griseb.）的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[22]。

在本研究中，小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)供試植物表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性，其中在不同濃度下小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)伴生種種子萌發(fā)都有明顯的抑制作用，隨著濃度的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng);此外，小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)三葉鬼針草、假臭草幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的化感抑制作用。充分說(shuō)明小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相對(duì)伴生種植物的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的化感抑制作用，且化感抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。根據(jù)供試植物的化感表現(xiàn)，筆者還對(duì)小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)石油醚萃取相的化學(xué)成分進(jìn)行了GC-MS分析，結(jié)果顯示小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)萃取相化學(xué)成分主要含有醇類、萜類、酯類、酸類、酚類、醛類、酸類等。根據(jù)上述研究結(jié)果，其中也含有多種能引起化感作物的化學(xué)成分，然而要明確其具體的化感成分，有待以后進(jìn)一步研究。本研究的重點(diǎn)結(jié)果是明確了小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)的入侵?jǐn)U散具有化感侵入的重要性，也初步篩選了化感活性成分類型，為進(jìn)一步研究小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)的入侵機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù);同時(shí)，本研究只選取石油醚萃取相進(jìn)行化學(xué)成分及其化感活性研究，存在一定的局限性。在下一步的工作中應(yīng)在活性篩選下開(kāi)展小花寬葉十萬(wàn)錯(cuò)乙酸乙酯萃取相、三氯甲烷萃取相、石油醚萃取相中化感物質(zhì)的分離純化。

參考文獻(xiàn)：

[1]Vilà M，Espinar J L，Hejda M，et al. Ecological impacts of invasive alien plants：a meta-analysis of their effects on species，communities and ecosystems[J]. Ecology Letters，2011，14：702-708.

[2]Rice E L. Allelopathy[M]. 2nd ed. New York：Academic Press，1984.

[3]Callaway R M，Aschehoug E T. Invasive plants versus their new and old neighbors：a mechanism for exotic invasion[J]. Science，2000，290（5491）：521-523.

[4]Wang R L，Staehelin C，Dayan F E，et al. Simulated acid rain accelerates litter decomposition and enhances the allelopathic potential of the invasive plant Wedelia trilobata （creeping daisy）[J]. Weed Science，2012，60（3）：462-467.

[5]潘玉梅，搖唐賽春，韋春強(qiáng)，等. 土著植物黃荊條水提取液對(duì)飛機(jī)草生長(zhǎng)和光合特性的化感效應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2013，32（2）：351-357.

[6]李軍，王瑞龍. 入侵植物腫柄菊葉片凋落物化感潛力的研究[J]. 生態(tài)科學(xué)，2015，34（6）：100-104.

[7]邵華，彭少麟，張弛，等. 薇甘菊的化感作用研究[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2003，22（5）：62-65.

[8]Song Q S，F(xiàn)u Y，Tang J，et al. Allelopathic potential of Eupatorium adenophorum[J]. Acta Phytoecologica Sinica，2000，24（3）：362-365.

[9]于興軍，于丹，馬克平. 不同生境條件下紫莖澤蘭化感作用的變化與入侵力關(guān)系的研究[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，28（6）：773-780.

[10]Baruah N C，Sarma J C，Sarma S，et al. Seed germination and growth inhibitory cadinenes from Eupatorium adenophorum spreng[J]. Journal of Chemical Ecology，1994，20（8）：1885-1892.

[11]黎華壽，黃京華，張修玉，等. 香茅天然揮發(fā)物的化感作用及其化學(xué)成分分析[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（4）：763-767.

[12]潘玉梅，唐賽春，韋春強(qiáng)，等. 土著植物黃荊條水提取液對(duì)飛機(jī)草生長(zhǎng)和光合特性的化感效應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2013，32（2）：351-357.

[13]Franck E D，Joanne G R. Investigating the mode of Natural phytotoxins[J]. Journal of Chemical Ecology，2000，26（9）：2079-2094.

[14]單家林. 海南島種子植物分布新記錄[J]. 福建林業(yè)科技，2009，36（3）：256-259.

[15]Skinner，Jordan. The invasive weed Chinese violet （Asystasia gangetica subspecies micrantha） now threatens northern Australia[J]. Plant Protection Quarterly，2015，30（4）：126-132.

[16]Hsu T W，Chiang T Y，Peng J J. Asystasia gangetica （L.） T. Anderson subsp. micrantha （Nees） Ensermu （Acanthaceae），a newly naturalized plant in Taiwan[J]. Taiwania，2005，50（2）：117-122.

[17]孔垂華，胡飛. 植物化感（相生相克）作用及其應(yīng)用[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：1-168.

[18]李紹文. 生態(tài)生物化學(xué)[M]. 北京：北京大學(xué)出版社，2001：45-69.

[19]Bradow J M，Connick W J. Seed germination inhibition by volatile alcohols and other compunds associated with Amaranthus palmeri residues[J]. Journal of Chemical Ecology，1988，14（7）：1633-1648.

[20]王大力，祝心如. 豚草的化感作用研究[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，1996，16（1）：11-19.

[21]周凱，郭維明，徐迎春. 菊科植物化感作用研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，24（8）：1776-1784.

[22]Wang W Z，Tan R X，Yao Y M. Sesquiterpene lactons from Ajania fruticulosa[J]. Phytochemistry，1994，37（5）：1347-1349.