外泌體在帕金森病中的研究進(jìn)展

孔凡叢， 呂占云綜述， 楊 燕審校

帕金森病(Parkinson disease，PD)是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的第二大的神經(jīng)退行性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、行動(dòng)遲緩和姿勢(shì)平衡障礙等運(yùn)動(dòng)癥狀。而外泌體廣泛存在于腦脊液和外周體液中，擁有細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和病原體的轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞碎片的清除等生理功能，且在PD發(fā)展過程中其內(nèi)容物發(fā)生改變。正是由于外泌體獨(dú)特的生理功能以及在PD的發(fā)病、發(fā)展及治療中所起到的作用而廣受關(guān)注[1]。本文就外泌體在PD中的相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 外泌體

細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)包含從細(xì)胞釋放的各種膜限制性囊泡(membrane-limited vesicles)。根據(jù)這些囊泡的來源或大小，大致分為三類：凋亡小體，微泡(MV)和外泌體[1，2]。其中外泌體是來自內(nèi)體系統(tǒng)(endosomal system)的最小和最具特征化的囊泡。外泌體是多泡體(multivesicular bodies，MVBs)與質(zhì)膜融合后形成的直徑為30～100 nm、密度范圍為1.13～1.19 g/ml之間并釋放到細(xì)胞外的膜性微囊泡，在電鏡下呈雙凹碟形或杯狀[2，3]。外泌體可以將多種特異性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、微小RNA和雙鏈DNA等特殊物質(zhì)在不同類型的細(xì)胞內(nèi)傳遞到鄰近或遠(yuǎn)距離的靶細(xì)胞，然后釋放所運(yùn)載的物質(zhì)，最后識(shí)別并作用于相應(yīng)的靶細(xì)胞。另外，外泌體調(diào)控許多重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，在免疫應(yīng)答、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)等過程中的作用均有相關(guān)報(bào)道，它既能成為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物，也能作為靶向藥物的載體進(jìn)行疾病治療[2]。同樣，在PD中外泌體可以介導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的交流，既可以促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)和生長(zhǎng)，也能促進(jìn)PD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展[4，5]。

2 外泌體在PD中的作用

2.1 α-突觸核蛋白與外泌體在PD中的作用 雖然PD的病理特征需進(jìn)一步研究，但目前研究表明PD患者腦中特異性蛋白質(zhì)即具有多巴胺能神經(jīng)毒性的α-突觸核蛋白的聚集是其病理特征之一。α-突觸核蛋白是路易體的組成成分之一，它是被外泌體包裹的突觸前神經(jīng)元蛋白[5]。α-突觸核蛋白從結(jié)構(gòu)上看是由140個(gè)氨基酸和3個(gè)區(qū)域組成，3個(gè)區(qū)域從功能上看，N-末端形成的α-螺旋在磷脂囊泡的結(jié)合中起作用，C-末端區(qū)域具有伴侶分子樣功能，“非Aβ組”在聚集過程中起重要的作用[6]。由于α-突觸核蛋白是路易體中異常蛋白質(zhì)沉積的主要成分，在PD發(fā)生發(fā)展過程中起著主要而肯定的作用[5]，且研究表明α-突觸核蛋白參與外泌體的運(yùn)輸活動(dòng)，因此越來越多的研究關(guān)注α-突觸核蛋白與外泌體在PD中的作用。

起初，相關(guān)研究表明α-突觸核蛋白僅在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其致病作用，但這一觀念被El-Agnaf等[7]打破，因?yàn)樗麄冊(cè)谌祟愌獫{和腦脊液中發(fā)現(xiàn)包含α-突觸核蛋白的外泌體可以在腦內(nèi)擴(kuò)散。Emmanouilidou等[8]通過SH-SY5Y細(xì)胞證明α-突觸核蛋白通過外泌體輸出，去影響鄰近神經(jīng)元的生存能力以促PD發(fā)展。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)這一過程可以進(jìn)一步誘導(dǎo)外泌體的形成、加速α-突觸核蛋白在腦內(nèi)的蓄積[9]，這與最近從PD患者的腦脊液中分離出外泌體的研究結(jié)果相符。此外，Stuendl等[10]發(fā)現(xiàn)外泌體α-突觸核蛋白水平與認(rèn)知障礙的嚴(yán)重程度有關(guān)，這從某種程度上證實(shí)臨床上部分PD患者發(fā)病后的幾年內(nèi)出現(xiàn)認(rèn)知功能的下降。α-突觸核蛋白通過外泌體輸出，這一觀點(diǎn)被Alvarez-Erviti等[11]進(jìn)一步證明。他們發(fā)現(xiàn)SHSY5Y細(xì)胞過表達(dá)的外泌體中含有α-突觸核蛋白，這些外泌體可以有效將α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)移至正常的SHSY5Y細(xì)胞，而且這些含有α-突觸核蛋白的外泌體抑制PD腦中溶酶體功能。從而導(dǎo)致外泌體中α-突觸核蛋白釋放增加，而這些蛋白向受體細(xì)胞擴(kuò)散范圍增加。Danzer等[12]試圖尋找外泌體相關(guān)的α-突觸核蛋白的特點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)在PD患者腦脊液中的外泌體以劑量依賴性方式誘導(dǎo)α-突觸核蛋白的寡聚化，在鑒定外泌體的α-突觸核蛋白寡聚體的過程中發(fā)現(xiàn)這些外泌體中α-突觸核蛋白寡聚體對(duì)鄰近細(xì)胞的毒性比不含外泌體的α-突觸核蛋白寡聚體更大。此外，還有其他相關(guān)研究支持外泌體在PD中的神經(jīng)毒性作用。Chang等[13]發(fā)現(xiàn)α-突觸核蛋白可以決定小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體分泌量，此外，活化的外泌體可以增加細(xì)胞凋亡，這支持了外泌體可能介導(dǎo)神經(jīng)變性的假說。

上述研究都進(jìn)一步證明聚集的α-突觸核蛋白可以在神經(jīng)元之間傳播的理論，該理論可以闡述PD逐漸發(fā)展的機(jī)制。由此表明α-突觸核蛋白表達(dá)的降低可以延遲或阻止PD進(jìn)展，并且通過外泌體降低α-突觸核蛋白表達(dá)來延緩或阻止PD的發(fā)展可以給PD帶來新的診治思路[11]。

2.2 Micro RNAs(miRNAs)與外泌體在PD中的作用 Micro RNAs(miRNAs)是一類在進(jìn)化上高度保守的非編碼RNA，在基因的轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞生長(zhǎng)、組織分化和細(xì)胞凋亡、遺傳和表觀遺傳等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，與腫瘤的發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等有著千絲萬縷的關(guān)系。單個(gè)miRNA可以調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)，因此一組miRNAs的改變可能會(huì)極大地影響PD的病理生理學(xué)和結(jié)局[14]。

有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-205的上調(diào)能抑制PD患者腦組織中LRRK2蛋白的異常上調(diào)[15]。miR-34b/c在PD患者腦組織表達(dá)下調(diào)，并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-34b/c的早期下調(diào)會(huì)觸發(fā)下游轉(zhuǎn)錄組改變，這些改變導(dǎo)致線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激，最終影響細(xì)胞活性[16]。同樣地，小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-7116-5p的下調(diào)促進(jìn)了TNF-α的產(chǎn)生，然后TNF-α進(jìn)一步刺激其他促炎因子的產(chǎn)生從而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷[17]。另外，miR-135a-5p的下調(diào)與ROCK2上調(diào)啟動(dòng)多巴胺能神經(jīng)元的吞噬功能[18]。對(duì)此，相關(guān)研究證實(shí)miR-135a-5p 激動(dòng)劑可能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受吞噬作用[18]。Kim等[19]發(fā)現(xiàn) miR-133b在中腦多巴胺能神經(jīng)元特異性表達(dá)，并可調(diào)控中腦多巴胺能神經(jīng)元的成熟和功能，但PD患者的中腦組織缺乏該miRNA。Doxakis等[20]發(fā)現(xiàn) miR-7和miR-153能與α-突觸核蛋白mRNA的3’非編碼區(qū)特異結(jié)合，下調(diào)該mRNA和α-突觸核蛋白的水平。Li等[21]發(fā)現(xiàn)外泌體MiR-221通過靶向作用PTEN來調(diào)節(jié)PC12細(xì)胞活力和凋亡，從而在PD中起保護(hù)作用。然而，上述與PD有關(guān)的特異性miRNA功能的實(shí)現(xiàn)需要借助外泌體的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。通過外泌體將這些miRNAs包裹，使其免受防御系統(tǒng)的識(shí)別、攻擊而產(chǎn)生的一系列免疫反應(yīng)，使其保證結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而干預(yù)PD發(fā)生、發(fā)展[14，22]。

包含miRNAs的外泌體作為PD的診斷性生物標(biāo)志物，可以在疾病的最早階段進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行治療，以延遲發(fā)病或延長(zhǎng)疾病發(fā)展到晚期階段的時(shí)間[14]。然而，也有研究表明其他器官的細(xì)胞也會(huì)分泌包含miRNA的外泌體并釋放到血液中，因此循環(huán)水平的miRNA可能無法準(zhǔn)確反映病變大腦本身特定miRNA的水平[23]，這也是外泌體相關(guān)研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。

2.3 基因與外泌體在PD中的作用 許多與PD相關(guān)的基因(包括LRRK2、VPS35和PARK9)在自噬和內(nèi)吞途徑中發(fā)揮重要的作用，并且有研究表明PD相關(guān)基因與外泌體發(fā)生和釋放相關(guān)。例如：LRRK2蛋白參與蛋白質(zhì)的分選、運(yùn)輸、自噬，以及外泌體的結(jié)合、釋放[24，25]，VPS35參與外泌體的內(nèi)體運(yùn)輸[26]，在外泌體中發(fā)現(xiàn)PARK9蛋白是P型轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶[27]，調(diào)節(jié)外泌體合成。此外，PARK9過表達(dá)減少了SH-SY5Ys細(xì)胞內(nèi)的α-syn水平，并增加了外泌體中的α-syn外顯化[28]。相反，PD患者的成纖維細(xì)胞失去PARK9調(diào)控后，多囊泡體中的腔內(nèi)囊泡數(shù)目減少，并且外泌體釋放到靶細(xì)胞的數(shù)量減少[29]。盡管有不少基因調(diào)控外泌體的發(fā)生、發(fā)展及功能應(yīng)用，但具體的調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究，以便將研究應(yīng)用到臨床中。

3 外泌體的應(yīng)用前景

外泌體擁有廣闊的應(yīng)用前景，原因在于其不僅擁有穩(wěn)定性、低免疫原性等特點(diǎn)，而且運(yùn)輸功能更為強(qiáng)大；可以運(yùn)載具有治療作用的siRNA(silencingRNA)、miRNA甚至是藥物，還可以運(yùn)載具有神經(jīng)毒性的α-突觸核蛋白。除此之外，最重要的一點(diǎn)是它可以穿過血腦屏障，將運(yùn)載物送達(dá)靶細(xì)胞[30]。

Shi等[31]研究發(fā)現(xiàn)即使腦脊液中外泌體α-突觸核蛋白被認(rèn)為是PD的生物標(biāo)志物，與對(duì)照相比，PD患者腦脊液中外泌體α-突觸核蛋白的含量較低，PD患者的血漿中外泌體α-突觸核蛋白的含量更高。該研究還發(fā)現(xiàn)這些血漿中α-突觸核蛋白在PD與對(duì)照者中的含量在靈敏度和特異性方面與CSFα-突觸核蛋白接近，血漿外泌體α-突觸核蛋白與疾病嚴(yán)重程度之間有顯著相關(guān)性。目前與α-突觸核蛋白有關(guān)的研究也支持含有α-突觸核蛋白的外泌體對(duì)PD的診斷治療具有一定的作用[32]。因此，阻止包含α-突觸核蛋白的外泌體釋放和攝取是有關(guān)PD的一種新型診療思路。

近期研究報(bào)道，與正常對(duì)照者相比，從PD患者的血細(xì)胞、血漿、血清和腦脊液外泌體中也可檢測(cè)到差異表達(dá)的miRNA，并且一些差異表達(dá)的miRNA 有助于PD的診斷。并且，結(jié)合的miRNA具有來源豐富、組織特異和高度穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此miRNA被認(rèn)為是適合作為PD 的生物標(biāo)志物[33]。

外泌體不僅可以用于診斷還能用于治療。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)血液外泌體可以穿過血腦屏障成功地將多巴胺送至紋狀體、黑質(zhì)，且在腦內(nèi)分布濃度可高達(dá)15倍。并且該研究還發(fā)現(xiàn)包裹多巴胺的外泌體的靶向治療不僅效果優(yōu)于靜脈內(nèi)注射游離的多巴胺，而且對(duì)神經(jīng)毒害作用更低[34]。

盡管外泌體有著廣泛用途，但外泌體也具有傳播如朊病毒樣蛋白質(zhì)[35]和病理性炎癥[36]等不利方面，所以外泌體在PD中的應(yīng)用依然還要走很長(zhǎng)的一段路。

4 小結(jié)與展望

雖然外泌體有很廣闊的應(yīng)用前景，但是我們還有許多的問題亟待解決，例如：神經(jīng)元細(xì)胞如何識(shí)別不同的外泌體，外泌體包裹的物質(zhì)如何被識(shí)別、卸載、利用，外泌體是如何穿過血腦屏障、如何逃避免疫反應(yīng)以及外泌體如何選擇需要運(yùn)載的物質(zhì)、同一細(xì)胞又會(huì)分泌多少種不同的外泌體。此外，用外泌體診斷治療PD對(duì)我們來說是一種新型的診療思路，這其中還有許多問題有待進(jìn)一步探討。