急性腦梗死患者血漿代謝物的相關(guān)性分析

由 楊， 段克非， 楊 銳

腦卒中是一種常見的具有高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率特點的腦血管疾病[1]。而急性缺血性腦卒中占腦卒中的60%～80%，它是由于各種原因?qū)е履X組織血液供應(yīng)障礙，并由此產(chǎn)生腦組織缺血缺氧性壞死，進而出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的一組綜合征[2]，給人們的生活質(zhì)量帶來極大的影響，故發(fā)現(xiàn)一些操作簡單，快速可靠且具有臨床預(yù)測價值的生物學(xué)標(biāo)記物顯得尤為重要。

代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后，致力于研究整個生物體的動態(tài)代謝狀態(tài)，被定義為“生物體對病理生理刺激或基因改變而產(chǎn)生的代謝物質(zhì)變化的定量測定”，是由Nicholson[3]早期所提出。該組學(xué)采用化學(xué)計量方法分析疾病導(dǎo)致的某些代謝物的改變，判斷疾病組和正常對照組差異，了解疾病的代謝途徑，尋找與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物，從而對疾病的輔助診斷與治療提供幫助。據(jù)報道，代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于多種疾病的診斷與治療中，如糖尿病腎病[4]、結(jié)核病[5]、胃腸道腫瘤[6]等疾病。然而目前，應(yīng)用基于代謝組學(xué)分析的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)探討血漿代謝物濃度改變與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性文獻相對少見。本文通過分析腦梗死組和對照組的代謝譜，尋找兩組間的差異性代謝物。發(fā)現(xiàn)具有預(yù)測價值的代謝標(biāo)記物，可以加深我們對疾病的認識，進而為臨床治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究主要納入2017年5月～2018年11月就診于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的患者，分為研究組和對照組。急性腦梗死患者入選標(biāo)準(zhǔn)參照《中國急性缺血性腦卒中指南診斷標(biāo)準(zhǔn)2014》[7]，本研究中腦梗死組患者入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性神經(jīng)功能缺損癥狀出現(xiàn)小于1 w；(2)頭部核磁共振彌散加權(quán)成像(DWI)確定為新發(fā)腦梗死；(3)美國國立衛(wèi)生研究院卒中評分量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)[8]分數(shù)大于4分。對照組患者入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)同期同年齡段健康體檢者；(2)無神經(jīng)功能缺損癥狀；(3)頭部CT/MRI排除近期梗死病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)腦出血(包括出血性腦梗死、腦室出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血或硬膜外血腫等)患者；(2)存在感染、創(chuàng)傷、昏迷；(3)嚴重肝腎疾病及惡性腫瘤；(4)近期大手術(shù)。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬一院倫理委員會審查和批準(zhǔn)，所有受試者均為自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法 所有受試者上午7時左右(住院患者入院次日)，于空腹條件下采集指尖血，滴入串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX 4000)檢測專用濾紙片的3個孔板中，形成直徑大于8 mm且分布均勻的血斑，晾干后送檢。應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜儀對所有樣本進行代謝組學(xué)分析，樣品檢測方法詳見參考文獻[9]，共測得93個指標(biāo)(包括23種氨基酸、35種肉堿和35個比值)。詳細詢問并記錄受試者一般臨床資料(年齡、性別、既往史、吸煙史和飲酒史)。

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床資料 本研究納入340例患者，其中研究組200例，對照組140例?；颊叩囊话闩R床資料見表1。

2.2 OPLS-DA回歸模型 應(yīng)用OPLS-DA方法分別對對照組和研究組患者血漿代謝物數(shù)據(jù)進行分析，得到相應(yīng)的散點分布圖(見圖1)。對照組和研究組沿橫軸(t軸)方向能明顯分開(R2Y=0.583、Q2Y=0.636)，說明其預(yù)測能力和解釋能力較強。本研究中Permutation試驗證明累計的R2和Q2值(左下部)明顯低于原始的R2和Q2(右上部)(見圖2)?？梢宰C實OPLS-DA模型是穩(wěn)定的、有效的。[截距：R2(0.0，0.176)，Q2(0.0，-0.295)]。

圖1 OPLS-DA散點圖(1.腦梗死組：綠色；2.對照組：藍色)

圖2 Permutation實驗

2.3 篩選組間差異性代謝物 篩選血漿中93個代謝物指標(biāo)。共同滿足VIP>1.0、AUC>0.7、P<0.01條件的指標(biāo)共13個(見表2)。分別是Arg、C26、Cit/Arg、C3DC、C18：1、C10：1、C4/C8、Met/Phe、C5-OH/C8、Leu、C4DC、C16：1-OH、C14：2。

2.4 篩選與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性代謝物 進一步篩選與腦梗死相關(guān)的差異性代謝物，將表2中的13個代謝物納入Logistical回歸模型，篩選出差異性指標(biāo)(P<0.05)。最終有8個指標(biāo)納入模型，分別是Leu、Cit/Arg、Arg、Met/Phe、C4/C8、C4DC、C18：1、C26。并得到回歸方程式Y(jié)=4.353*C18：1+0.012*Leu-0.748*C4/C8+0.620*Cit/Arg-0.235*Arg+8.461*Met/Phe-3.474*C4DC+70.484*C26-10.285。根據(jù)此方程式，我們計算一個綜合性指標(biāo)N。篩選出的8個代謝物和綜合性指標(biāo)N在兩組間的表達量詳見小提琴圖(見圖3)和相關(guān)性圈圖(見圖4)。

2.5 檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測疾病的準(zhǔn)確性 應(yīng)用ROC曲線圖預(yù)測模型的精準(zhǔn)性。其AUC值越大，代表模型預(yù)測的準(zhǔn)確性越高(見圖5)。設(shè)定的新指標(biāo)N為8種代謝物的綜合性指標(biāo)，其AUC值為0.977，大于其他所有代謝物的AUC值，提示結(jié)合多種代謝物會提高對疾病的診斷價值。

表1 患者一般臨床資料

注：a應(yīng)用卡方檢驗；b應(yīng)用獨立樣本t檢驗

表2 篩選兩組主要差異指標(biāo)

由左上至右下指標(biāo)分別為：N、Leu、Cit/Arg、Arg、Met/Phe、C4/C8、C4DC、C18：1、C26

圖4 相關(guān)性圈圖

圖5 ROC曲線

3 討 論

多年來，腦梗死的發(fā)病率及病死率在全球范圍內(nèi)始終居高不下，尋找新的診治方案迫在眉睫。近年來，代謝組學(xué)是一種很有前途的檢測方法，廣泛的應(yīng)用于各種疾病的診治。因此，本研究選定氨基酸和肉堿為相關(guān)的代謝物，并對其量化，比較研究組與對照組之間代謝譜差異，為疾病早期而準(zhǔn)確的診斷提供有力的幫助。

本研究對血漿代謝物進行多次篩選，最終得到8個指標(biāo)與腦梗死密切相關(guān)，分別是：亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸/精氨酸、甲硫氨酸/苯丙氨酸、C18：1、C26、C4DC、C4/C8。本文結(jié)果顯示亮氨酸、瓜氨酸/精氨酸、甲硫氨酸/苯丙氨酸、C18：1、C26含量在腦梗死組較低，而精氨酸、C4DC、C4/C8含量較高。

3.1 氨基酸：亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸/精氨酸、甲硫氨酸/苯丙氨酸 亮氨酸：亮氨酸為生酮氨基酸，也是支鏈氨基酸(branched chainaminoacids，BCAA)，包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸，是直接或間接影響代謝的重要營養(yǎng)信號[10]。亮氨酸越來越多的應(yīng)用于腦血管疾病的診治中，為疾病提供可靠的信息。其機制可能為亮氨酸代謝酶基因的表達存在異常，從而導(dǎo)致血漿亮氨酸水平升高[11]。Kimberly等[12]發(fā)現(xiàn)無論是人或者動物的缺血性腦卒中，亮氨酸水平都有所下降[13]。同樣Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在急性缺血性卒中患者的血漿和腦脊液中觀察到支鏈氨基酸水平下降。以上研究結(jié)果均與本文研究結(jié)果相一致。此外，Nachbaue 等[15]發(fā)現(xiàn)對術(shù)后、創(chuàng)傷和各種疾病患者，運用合適的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸比例的氨基酸液能明顯改善氮平衡營養(yǎng)狀況，從而有利于患者的傷口愈合和機體恢復(fù)。

精氨酸(Arg)、瓜氨酸/精氨酸(Cit/Arg)：本文中Cit/Arg在腦梗死組含量低，而Arg含量高。研究表明在瓜氨酸和一氧化氮(NO)之間存在一種動態(tài)平衡稱作瓜氨酸-一氧化氮循環(huán)[16]。當(dāng)Arg缺乏，N0合成會減少，機體將加快對Arg轉(zhuǎn)運以促進NO合成，來滿足機體正常代謝需求，當(dāng)NO合成速率加快，終產(chǎn)物NO和Cit生成增多，過多的終產(chǎn)物若不及時清除，將導(dǎo)致Cit堆積，堆積的Cit與Arg相互競爭酶的結(jié)合位點，從而抑制NO生成，最終導(dǎo)致NO、Cit生成均下降。Cherian[17]和丁俊麗[18]發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血早期使用左旋精氨酸可以加速缺血區(qū)域NO含量，對腦起保護作用。本研究得出的結(jié)果可能與氨基酸代謝途徑異?；駽it-NO循環(huán)被破壞相關(guān)。此外，NO屬于一類重要的內(nèi)皮功能舒張調(diào)節(jié)因子，其與高血壓的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[19]，同時NO可產(chǎn)生過多的氧自由基，加重血管內(nèi)皮細胞損傷[20]。

甲硫氨酸/苯丙氨酸(Met/Phe)：本文研究結(jié)果提示，在腦梗死組Met/Phe含量低。甲硫氨酸參與甲硫氨酸循環(huán)，在此循環(huán)中甲硫氨酸提供SAM，SAM轉(zhuǎn)甲基后轉(zhuǎn)變?yōu)镾AH，進一步水解生成同型半胱氨酸，Hcy可促進動脈粥樣硬化發(fā)生及血栓形成[21]，促進腦梗死形成。苯丙氨酸為芳香族氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，血液中苯丙氨酸水平增高，腦電圖異常率明顯增高，不同程度的增加腦缺血的發(fā)生[22]。鄒卉等[23]發(fā)現(xiàn)高苯丙氨酸加重患兒腦缺血和不同程度的腦損傷。結(jié)合上文所述，低水平的Met、Phe或Met/Phe可能對人體有利，可能會減少腦梗死的發(fā)生。

3.2 肉堿：長鏈酰基肉堿(C18：1、C26)、短鏈?；鈮A(C4DC、C4/C8) 人體內(nèi)肉堿根據(jù)碳含量可分為長鏈?；鈮A和短鏈?；鈮A，主要存在于心肌、骨骼肌等肌肉中。研究指出，肉堿有重要生理的作用：(1)參與脂肪酸β氧化，提高代謝率；(2)抗氧化作用；(3)參與支鏈氨基酸代謝[24]。本文研究顯示在腦梗死組C18：1、C26較低，而C4DC、C4/C8較高。在脂肪酸β氧化中，若肉堿(CO)缺乏或肉堿轉(zhuǎn)移酶異常，將導(dǎo)致脂質(zhì)代謝障礙，加重微小血管損害，有可能誘發(fā)腦梗死。Deutsch 等[24]研究得出長鏈?；鈮A含量在腦梗死組和正常組大鼠腦之間沒有差異。Slivka等[25]研究表明長鏈酰基肉堿含量未改變也未減少腦梗死面積的大小。以上均與本文研究結(jié)果有所差異，具體機制仍需進一步探討。Rousseau等[26]研究發(fā)現(xiàn)在缺血時，短鏈?；鈮A含量有所增加，且與血漿支鏈氨基酸(BCAA)水平顯著相關(guān)，且P<0.001，對腦細胞起保護作用，減少腦缺血的發(fā)生。與本文研究結(jié)果一致。此外，國外有研究發(fā)現(xiàn)左旋肉堿和乙酰化衍生物乙?；笮鈮A可以改善成人、新生兒和小兒腦損傷模型中的能量狀態(tài)，減少氧化應(yīng)激并防止隨后的細胞死亡。

綜上所述，亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸/精氨酸、甲硫氨酸/苯丙氨酸、肉堿(C18：1、C26、C4DC、C4/C8)等代謝物指標(biāo)在腦梗死組和對照組中有所差異。腦梗死患者體內(nèi)氨基酸和肉堿代謝異常，打破了體內(nèi)正常物質(zhì)能量轉(zhuǎn)運代謝庫，進而出現(xiàn)代謝障礙。對于癥狀輕微或隱匿的人而言，若能檢測出這些異常的氨基酸和肉堿代謝指標(biāo)，對于腦梗死的診斷和預(yù)防有一定的指導(dǎo)意義。本文研究不足之處在于，不能將全部與腦梗死相關(guān)的代謝指標(biāo)進行建模，且樣本量較少。需擴大樣本量，進一步證實這些異常代謝指標(biāo)與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。對于人為干預(yù)某些氨基酸和肉堿濃度能否降低腦梗死的發(fā)病仍需進一步研究。