余艷艷 譚云洪 陳振華 陳忠南 劉彬彬 王玨

結(jié)核病目前仍然是嚴(yán)重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。WHO指出，2016年全球1040萬(wàn)例結(jié)核病感染者中10%的患者同時(shí)并發(fā)HIV感染；2016年全球130萬(wàn)例結(jié)核病死亡患者中有37.4萬(wàn)例并發(fā)HIV感染[1]。結(jié)核病是HIV感染者最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)感染之一，是HIV感染者疾病進(jìn)展的重要促進(jìn)因素[2]。國(guó)外有研究報(bào)道[3],結(jié)核病是艾滋病患者(AIDS患者)(包括已接受抗病毒治療的患者)死亡的重要因素。HIV感染并發(fā)結(jié)核病由于病情復(fù)雜，因此診斷更為困難[4]。因此，在HIV感染者中對(duì)結(jié)核病進(jìn)行早期篩查與診斷尤為重要。而HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者的臨床癥狀不典型、影像學(xué)表現(xiàn)無(wú)特異性、實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查陽(yáng)性率低，從而導(dǎo)致診斷困難，延誤病情[5]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immune sorbent assay，ELISA)作為γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)的一種檢測(cè)技術(shù)，在診斷結(jié)核病方面得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。因此，本研究通過(guò)對(duì)2015年1月至2018年9月湖南省胸科醫(yī)院就診的HIV感染并發(fā)結(jié)核病的患者采用包括ELISA在內(nèi)的3種檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行診斷性研究，以分析ELISA對(duì)HIV感染并發(fā)結(jié)核病的診斷價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

搜集2015年1月至2018年9月湖南省胸科醫(yī)院臨床就診的肺部疾病患者，共4568例，用ELISA法檢測(cè)血清HIV抗體陽(yáng)性，并經(jīng)湖南省疾病預(yù)防控制中心采用免疫印跡法確診為陽(yáng)性的患者114例。HIV感染者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒布的《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 293—2008)》[6]。114例HIV感染患者中，按照《WS 288—2008 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]，且經(jīng)過(guò)診斷性抗結(jié)核藥物治療，確診為HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者95例，確診為HIV感染并發(fā)非結(jié)核性肺疾病患者19例。其中男100例(87.72%)，女14例(12.28%)；30歲以下年齡段10例(8.77%)，30～歲年齡段53例(46.49%)，50～歲年齡段47例(41.23%)，≥70歲年齡段4例(3.51%)。95例HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者中包括5例繼發(fā)性肺結(jié)核并發(fā)淋巴結(jié)結(jié)核，3例繼發(fā)性肺結(jié)核并發(fā)結(jié)核性胸膜炎，7例繼發(fā)性肺結(jié)核并發(fā)淋巴結(jié)結(jié)核，1例繼發(fā)性肺結(jié)核并發(fā)腸結(jié)核，2例血行播散性肺結(jié)核，77例繼發(fā)性肺結(jié)核。19例HIV感染并發(fā)非結(jié)核性肺疾病中包括6例支氣管擴(kuò)張，9例慢性阻塞性肺疾病(急性發(fā)作期)，1例非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染，3例肺部感染。

二、研究方法

(一)標(biāo)本留取

用無(wú)菌肝素鈉抗凝管抽取每例患者的新鮮靜脈全血≥3 ml,進(jìn)行ELISA檢測(cè)；均收集每例患者的痰標(biāo)本(每份樣本≥3 ml)，同一份痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)和分枝桿菌BACTEC MGIT 960(簡(jiǎn)稱“MGIT 960”)檢測(cè)。

(二)檢測(cè)方法

1.ELISA：采用海口維提璦生物研究院研制的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。無(wú)菌技術(shù)下使用肝素鈉管采集的新鮮靜脈全血≥3 ml，于室溫儲(chǔ)存和運(yùn)輸，16 h內(nèi)進(jìn)行樣品刺激。編號(hào)反應(yīng)管“樣本號(hào)-N”(表示陰性對(duì)照管)，“樣本號(hào)-P”(表示陽(yáng)性對(duì)照管)，“樣品號(hào)-T”(表示檢測(cè)管)。分別加入相應(yīng)的刺激劑(修飾后的培養(yǎng)濾液蛋白-10和早期分泌抗原靶-6)，吸取1 ml靜脈全血加入相應(yīng)編號(hào)的反應(yīng)管中并孵育22～24 h，將血漿上清移入標(biāo)記好的1.5 ml Ependorff管(EP管)中。按照該試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀讀取450 nm處的光密度值(A值)。計(jì)算結(jié)果，得出(P-N)和(T-N)值。當(dāng)N<0.5 IU/ml時(shí)，(T-N)/(P-N)≥0.60時(shí)判為陽(yáng)性，否則為陰性。當(dāng)N≥0.5 IU/ml，(T-N)/(P-N)≥0.85時(shí)判為陽(yáng)性，否則為陰性(當(dāng)P-N≥10 IU/ml 時(shí)，按P-N=10 IU/ml 計(jì)算)。

2.GeneXpert：按照GeneXpert操作說(shuō)明書進(jìn)行前處理。取1 ml痰標(biāo)本加入管中，加入2倍痰體積的標(biāo)本處理液，振蕩20 s后，靜置15 min，用專用吸管取2 ml處理后的標(biāo)本液緩慢加入反應(yīng)盒的加樣孔內(nèi)。開(kāi)啟GeneXpert儀和電腦，待自檢通過(guò)后，將反應(yīng)盒放入模塊中，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增，以及目標(biāo)序列的檢測(cè)和結(jié)果判斷。

3. MGIT 960：按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[8]進(jìn)行操作。

三、儀器與試劑

ELISA試劑盒由?？诰S瑅璦生物研究所提供。MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。GeneXpert檢測(cè)儀器和試劑盒均由美國(guó)Cepheid公司提供。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)陽(yáng)性率、敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值的比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 陽(yáng)性檢出基本情況

95例臨床診斷的HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者中，GeneXpert檢出陽(yáng)性40例，陽(yáng)性率為42.11%(40/95)；MGIT 960檢測(cè)陽(yáng)性者45例，陽(yáng)性率為47.37%(45/95)； ELISA檢測(cè)陽(yáng)性者64例，其中不確定結(jié)果8例，陽(yáng)性率67.37%(64/95)。ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性率高于GeneXpert和MGIT 960檢測(cè)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=50.031，P=0.000)。19例HIV并發(fā)非結(jié)核性肺疾病患者中GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性者0例； MGIT 960檢測(cè)陽(yáng)性者0例； ELISA檢測(cè)陽(yáng)性者 3例。

二、 ELISA試驗(yàn)的診斷效能

以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測(cè)的敏感度和特異度分別為42.11%和100.00%；MGIT 960檢測(cè)的敏感度和特異度分別為47.37%和100.00%； ELISA檢測(cè)的敏感度和特異度分別為73.56%和84.21%，見(jiàn)表1。

討 論

IGRA原理為檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞或(和)全血在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下釋放γ-干擾素(IFN-γ)的水平，判斷受檢者是否感染結(jié)核。目前主要應(yīng)用的檢測(cè)方法為：酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)和ELISA[9]。IGRA目前主要在活動(dòng)性結(jié)核病的輔助診斷、兒童MTB感染的排查和HIV感染等免疫抑制或免疫缺陷者M(jìn)TB潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)診斷中應(yīng)用[10]。本研究結(jié)果顯示，ELISA檢測(cè)在HIV感染并發(fā)結(jié)核病中診斷的陽(yáng)性率高于GeneXpert和MGIT 960，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，ELISA檢測(cè)的敏感度高于GeneXpert和MGIT 960。

表1 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)3種檢測(cè)技術(shù)診斷HIV感染并發(fā)結(jié)核病的效能

注ELISA試驗(yàn)中有8例HIV感染并發(fā)結(jié)核病者的結(jié)果不確定。敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性+假陰性例數(shù))×100%

本研究中ELISA檢測(cè)的特異度為84.21%，低于GeneXpert和 MGIT 960。原因可能為本研究以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，有些患者為非結(jié)核分枝桿菌NTM和MTB的混合感染，但臨床上患者結(jié)核病表現(xiàn)不明顯；部分患者既往感染了MTB但為非活動(dòng)性肺結(jié)核，本次是因?yàn)楹粑榔渌膊∪缰夤軘U(kuò)張、慢性阻塞性肺疾病(急性發(fā)作期)就診；有些患者感染了與IGRA檢測(cè)抗原相交叉的NTM,如海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等有關(guān)；湖南省是結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，不少患者為L(zhǎng)TBI的可能性較大[11-13]。以上這些原因使得部分HIV感染并發(fā)非結(jié)核性肺疾病患者出現(xiàn)ELISA試驗(yàn)陽(yáng)性。有文獻(xiàn)報(bào)道，IGRA試驗(yàn)檢測(cè)效能受MTB感染流行情況等影響，在低風(fēng)險(xiǎn)人群中檢測(cè)的特異度較好，但在有潛在MTB感染的高危人群中檢測(cè)的特異度明顯降低[14-16]。國(guó)外研究顯示，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)診斷HIV感染并發(fā)活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度和特異度分別為37.2%和88.7%[17]，并建議在免疫功能高度抑制的AIDS患者中不推薦T-SPOT.TB的診斷方法，敏感度低的原因可能與在晚期HIV感染的患者中CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少及功能降低。然而T-SPOT.TB是否確實(shí)受CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能影響，目前尚有爭(zhēng)議；Nahid等[18]的研究顯示，在HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者中，T-SPOT.TB檢測(cè)的陽(yáng)性率并不受CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。這些研究說(shuō)明，T-SPOT.TB具有一定輔助診斷價(jià)值，但陰性檢測(cè)結(jié)果也不能完全排除結(jié)核病。有研究指出，ELISA和PPD試驗(yàn)均是檢測(cè)患者細(xì)胞免疫反應(yīng)，用MTB特異性抗原刺激患者T淋巴細(xì)胞，觀察是否有特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)間接判斷是否感染MTB；因?yàn)檎Ｈ说腃D4+T淋巴細(xì)胞約占總T淋巴細(xì)胞的65%，所以這兩種檢測(cè)方法均與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性有關(guān)[19-20]。同時(shí)有文獻(xiàn)指出，ELISA陰性可以排除未受到嚴(yán)重免疫抑制的HIV感染成人的活動(dòng)性結(jié)核病[21]。

有學(xué)者研究表明，由于ELISA試驗(yàn)設(shè)置了空白對(duì)照管和陽(yáng)性對(duì)照管，可以評(píng)價(jià)被檢者的基礎(chǔ)免疫狀態(tài)和試驗(yàn)操作是否得當(dāng)(陽(yáng)性對(duì)照管)來(lái)排除受試者體內(nèi)嗜異性抗體效應(yīng)和非特異性的IFN-γ等影響(空白對(duì)照管)，從而提高了方法學(xué)的可靠性[22-24]。HIV感染人群中，LTBI潛伏性感染者僅1年中就有約10%的幾率發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病，遠(yuǎn)超非HIV感染人群[25]。LTBI和活動(dòng)性結(jié)核病是相互關(guān)聯(lián)而非相互獨(dú)立的，特別是在HIV感染者中，可能在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)經(jīng)歷了LTBI、亞臨床結(jié)核病到活動(dòng)性結(jié)核病的病情轉(zhuǎn)變[26]。因此，在HIV感染者中對(duì)LTBI者的早期檢測(cè)手段至關(guān)重要。由于ELISA檢測(cè)有著較高的敏感度和特異度，并且檢測(cè)快捷，故對(duì)HIV感染并發(fā)結(jié)核病的輔助診斷有一定的意義。

本研究不足之處在于：ELISA試驗(yàn)中由于檢測(cè)管淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ受被檢者淋巴細(xì)胞數(shù)量、活力、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、是否吸煙、高濃度C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)等多種因素影響[27-28]，本研究未能深入分析這些因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的具體影響，也不知8例不確定結(jié)果的具體原因。GeneXpert與 MGIT 960屬于病原學(xué)檢測(cè)方法，標(biāo)本來(lái)源于痰液；ELISA屬于免疫學(xué)檢測(cè)方法，標(biāo)本來(lái)源于血液。有研究顯示[29],痰標(biāo)本的性狀與痰菌檢查結(jié)果密切相關(guān)，以干酪痰和膿性痰陽(yáng)性檢出率較高，血性痰及泡沫樣痰陽(yáng)性率較低。痰標(biāo)本的性狀對(duì)GeneXpert和 MGIT 960檢測(cè)結(jié)果有一定影響。不同的標(biāo)本來(lái)源及標(biāo)本性狀對(duì)GeneXpert、MGIT 960與ELISA檢測(cè)結(jié)果存在不同影響。目前臨床上HIV感染并發(fā)結(jié)核病的病原學(xué)陽(yáng)性檢出率低，鑒于ELISA檢測(cè)的高敏感度與特異度，故將其與GeneXpert及 MGIT 960進(jìn)行比較，以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)ELISA的臨床診斷價(jià)值。另外，由于本研究HIV感染并發(fā)非結(jié)核性肺疾病患者例數(shù)少，有待增大樣本量進(jìn)一步研究，以便正確評(píng)價(jià)ELISA檢測(cè)技術(shù)在HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者中的臨床診斷價(jià)值。