唐怡敏 張娟娟 葉濤生 張國良 劉映霞

結(jié)核性胸膜炎是最常見的胸膜疾病之一，占胸腔積液性疾病的30%～60%[1]。結(jié)核性胸膜炎常見的并發(fā)癥為胸膜肥厚粘連、胸腔積液形成，如果經(jīng)久不愈，將出現(xiàn)胸廓塌陷、肺不張、膿胸、支氣管胸膜瘺等嚴重并發(fā)癥，直接影響患者生存質(zhì)量。故早期診斷結(jié)核性胸膜炎胸膜粘連程度，對進一步診治及患者預后有著重要意義。筆者通過對結(jié)核性胸膜炎患者外周血和胸腔積液的常規(guī)及生化檢查，統(tǒng)計分析結(jié)核性胸膜炎粘連程度與臨床指標的相關(guān)性，尋找可能預測結(jié)核性胸膜炎患者胸膜粘連的早期臨床指標，以提高臨床防范胸膜粘連的意識和方法。

對象和方法

一、 研究對象

1.一般資料：選取2015年3月至2017年3月深圳市第三人民醫(yī)院呼吸科確診為結(jié)核性胸膜炎、病程超過1個月、未進行規(guī)范抗結(jié)核藥物治療的134例患者，排除免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病、惡性腫瘤、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染，以及嚴重心、肝、肺、腎臟等疾病。

134例患者中，男72例(53.73%)，女62例(46.27%)；年齡16～63歲，平均(35.05±14.06)歲。依據(jù)內(nèi)科胸腔鏡下胸膜粘連程度分為無胸膜粘連者32例(23.88%，無粘連組)和胸膜粘連者102例(76.12%，粘連組)。入院后行外周血和胸腔積液常規(guī)檢查[包括C-反應蛋白(CRP)、血紅細胞沉降率(ESR)]、生化指標檢測[包括腺苷脫氨酶(ADA)、乳酸脫氫酶(LDH)、單核細胞百分比(MONO%)]、酶聯(lián)免疫斑點檢測(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)；以及使用CT掃描測量胸腔積液和胸膜的厚度，并對結(jié)果進行分級評分[2]。

2.結(jié)核性胸膜炎確診依據(jù)[2]：(1)胸腔積液和胸膜活檢行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性；(2)胸腔鏡取胸膜活檢發(fā)現(xiàn)肉芽腫，結(jié)合臨床癥狀及病理、生化檢查提示結(jié)核病。二者有其一即可。

二、研究方法

1.內(nèi)科胸腔鏡檢查：采用內(nèi)科胸腔鏡檢查技術(shù)，從上至下、由近而遠的對壁層和臟層胸膜、橫膈和縱隔面進行全面檢查，對胸膜粘連進行定量判定；并選取可疑部位直視下多點位3～5塊壁層胸膜活體組織送檢病理檢查。

胸膜粘連判定方法如下[2-5](圖1～5)：0級：胸膜見充血腫脹，散在結(jié)節(jié)，但胸膜腔內(nèi)均無胸膜粘連；1級：整個胸膜腔內(nèi)見1～3條經(jīng)牽拉即可分離的疏松且薄的胸膜粘連帶；2級：胸膜腔1個區(qū)域內(nèi)有3條及以上粘連帶，鈍性即可分離的胸膜粘連，整個胸膜腔可以顯露；3級：胸膜腔的每個區(qū)域均有散在的粘連帶，部分胸膜腔粘連不能顯露，分離胸膜粘連時可出現(xiàn)胸膜出血或損傷；4級：大部分胸膜腔由于粘連而閉合，僅能顯露小部分胸膜腔，分離胸膜粘連時可出現(xiàn)胸膜出血或損傷。0級為正常胸膜，1～2級為輕度胸膜粘連，3～4級為重度胸膜粘連。本次統(tǒng)計分析將0級歸為無胸膜粘連組，將1～4級歸為有胸膜粘連組。

2.外周血和胸腔積液結(jié)核免疫方法(PBMC-ELISPOT和PFMC-ELISPOT)[6]：ELISPOT法主要檢測結(jié)核分枝桿菌特異性抗原A(ESAT-6：早期分泌抗原靶分子)或多肽Peptide體外刺激T細胞后γ干擾素(IFN-γ)釋放水平。

首先采集患者的外周血和胸腔積液標本，于2 h內(nèi)常規(guī)分離單個核淋巴細胞(分別為PBMC和PFMC)，隨后加入一定量的1640培養(yǎng)基，將細胞濃度調(diào)整為2×106/ml。取100 μl細胞懸液加入到已包被IFN-γ單克隆抗體的96個孔板中，每個樣本對應4個孔，陽性對照孔中加入10 μl植物血凝素(PHA)做對照[即用無血清培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成50 μg/ml]，終濃度為10 μg/ml；陰性對照中只加培養(yǎng)基，A抗原孔加入10 μl ESAT6抗原，B抗原孔加入10 μl Peptide抗原。孵育條件：37 ℃，5%CO2，時間 14～16 h。第2天洗板后，加入100 μl檢測抗體于CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，洗板后再加入100 μl親和素繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，繼而洗板，最后加入顯色劑顯色。E6和peptide刺激PBMC和PFMC細胞產(chǎn)生PBMC-ELISPOT-E6(簡稱“PBMC-E6”)、PBMC-ELISPOT-peptide(簡稱“PBMC-peptide”)、PFMC-ELISPOT-E6(簡稱“PFMC-E6”)、PFMC-ELISPOT-peptide(簡稱“PFMC-peptide”)免疫復合物，所釋放的IFN-γ水平待顯色洗板后最終以斑點的形式出現(xiàn)，通過手動計數(shù)斑點數(shù)量或者通過ELISPOT斑點讀版儀獲得以上4組免疫復合物數(shù)據(jù)(單位是SFCs/孔)，進行統(tǒng)計分析。

3.細菌學檢測：(1)抗酸桿菌萋-尼染色法[7]：混勻胸腔積液標本并取0.05～0.1 ml均勻涂抹在載玻片，烤干后滴加石碳酸復紅染液，待干燥后滴加脫色劑，用蒸餾水清洗后再次滴加亞甲藍染料，待干燥后鏡下觀察細菌的數(shù)量，以判定是否陽性。(2)MGIT 960液體培養(yǎng)[8]：胸腔積液離心3000×g15 min，向沉淀中加入1 ml PBS，取0.5 ml樣本接種到已經(jīng)準備好的MGIT培養(yǎng)管和BacT/ALERT培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)樣本置于BACT/MGIT 960 3D全自動培養(yǎng)箱(37 ℃恒溫培養(yǎng)箱)中進行培養(yǎng)。

4.血常規(guī)及生化檢測：(1)ADA、LDH、CRP、MONO%測定[9-10]：嚴格按照測定試劑盒中的說明書，采用全自動血常規(guī)檢測儀器進行測定。(2)ESR測定：嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版[11]中ESR測定的方法進行檢測并記錄其結(jié)果。

5.CT測量胸腔積液和胸膜厚度的分級及評分標準[2]：對CT檢查中的7種征象(結(jié)節(jié)、微結(jié)節(jié)、實變、支氣管損傷、磨玻璃樣病變、空洞、間質(zhì)損傷)采用5級評分法進行評分。其中0級：沒有大陰影，記為0分；1級：全部大陰影的面積不超過該層面的1/4，記為1分；2級：全部大陰影的面積占該層面的1/4～1/2，記為2分；3級：全部陰影的面積占該層面的1/2～3/4，記為3分；4級：全部大陰影的面積超過該層面的3/4肺受累，記為4級。所得評分相加即為總分。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、 兩組患者各檢測指標情況

通過兩組間多個指標的比較，發(fā)現(xiàn)胸膜粘連組患者胸腔積液中的LDH和ADA水平均明顯高于無粘連組患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；而其他檢測指標與患者后期胸膜粘連的程度均差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)。

二、 ADA、LDH檢測水平對結(jié)核性胸膜炎早期篩查胸膜粘連的檢測效能

通過Graphpad軟件對有統(tǒng)計學意義的ADA、LDH檢測水平進行ROC曲線分析，繪制ROC曲線確定ADA、LDH值在診斷結(jié)核性胸膜炎胸膜粘連時曲線下面積(95%CI)分別為0.84(0.76～0.93)、0.89(0.82～0.96)，數(shù)值均接近“1”，說明胸腔積液中ADA、LDH數(shù)值對于診斷結(jié)核性胸膜炎后期胸膜粘連具有較高的診斷價值。以ROC曲線上約登指數(shù)最大切點(分別為0.63、0.58)所對應的ADA、LDH數(shù)值(分別為62.85 U/L、393.50 U/L)作為結(jié)核性胸膜炎后期胸膜粘連診斷的最佳臨界點，其所對應的檢測敏感度和特異度分別為 81.30%和81.82%、84.35%和73.68%(圖6～9)。

表1 各檢測指標在兩組患者中的水平分布

圖6 胸腔積液中ADA值與結(jié)核性胸膜炎后期胸膜粘連的關(guān)系散點圖 圖7 胸腔積液中ADA值與結(jié)核性胸膜炎后期胸膜粘連的關(guān)系ROC曲線圖 圖8 胸腔積液中LDH值與結(jié)核性胸膜炎后期胸膜粘連的關(guān)系散點圖 圖9 胸腔積液中LDH值與結(jié)核性胸膜炎后期胸膜粘連的關(guān)系ROC曲線圖

圖6、7使用Graphpad軟件處理顯示胸腔積液中ADA值與結(jié)核性胸膜炎后期胸膜粘連的關(guān)系。圖6為散點圖，可見ADA在結(jié)核性胸膜炎后期出現(xiàn)胸膜粘連組中比無粘連組中明顯增加；圖7為ROC曲線圖，可以看到利用ADA在診斷結(jié)核性胸膜炎后期是否發(fā)生胸膜粘連有較高的敏感度和特異度。

圖8、9使用Graphpad軟件處理顯示胸腔積液中LDH值與結(jié)核性胸膜炎后期胸膜粘連的關(guān)系。圖8為胸腔積液中LDH在粘連組和無粘連組中的散點圖，可見LDH在結(jié)核性胸膜炎后期出現(xiàn)胸膜粘連組中比無粘連組中明顯增加；圖9為ROC曲線確定LDH在診斷結(jié)核性胸膜炎后期胸膜粘連中的敏感度與特異度，可見利用LDH診斷結(jié)核性胸膜炎后期是否發(fā)生胸膜粘連有較高的敏感度和特異度。

討 論

胸膜肥厚粘連是由于結(jié)核分枝桿菌及其代謝產(chǎn)物作用于胸膜而發(fā)生炎癥，使胸膜毛細血管壁通透性增加，壁層胸膜與臟層胸膜產(chǎn)生較多液體，大量纖維蛋白及血細胞滲入到胸膜腔液體中，形成胸腔積液；隨著病程的遷延，纖維蛋白沉積在胸膜上，形成膜樣分隔或包裹性胸腔積液[12]。

正常情況下，胸腔尖頂區(qū)的壁層胸膜產(chǎn)生少量的液體有利于肺的擴張及減小呼吸時產(chǎn)生的摩擦，通過胸腔最基底區(qū)的膈面和縱隔面壁層胸膜上的淋巴管微孔進行重吸收，兩者保持動態(tài)平衡[13]。當發(fā)生結(jié)核性滲出性胸膜炎時，其臟、壁層均生成較多液體進入胸膜腔，由于胸腔內(nèi)肉芽組織、干酪樣壞死物影響了淋巴管微孔對感染性胸腔積液的吸收能力，引起動態(tài)平衡紊亂，導致胸膜腔內(nèi)滲液急劇增多，纖維蛋白也隨之增加，胸膜粘連、增厚的風險也隨之加大，且隨炎癥的加重而愈發(fā)明顯；當發(fā)生結(jié)核性干性胸膜炎時，反復的感染和炎癥刺激可導致治療效果不佳的包裹性胸腔積液，特別是多房性包裹性積液的大量產(chǎn)生，最終可導致胸膜增厚、鈣化，甚至形成膿胸、支氣管胸膜瘺，嚴重者還可出現(xiàn)肺膨脹不全、支氣管擴張等不可逆改變，以及重度胸廓塌陷、胸廓畸形等限制性肺功能障礙，嚴重影響患者的健康水平和生命質(zhì)量。

胸膜增厚粘連早期可通過胸部CT掃描來判斷[14]，近年來也有學者用超聲來評估，但兩種方法敏感度均較低，且不直接，易受儀器和主觀判斷干擾[15]。內(nèi)科胸腔鏡手術(shù)操作簡單、安全、損傷小、并發(fā)癥少，可由呼吸內(nèi)科醫(yī)師獨立完成，并可獲得組織病理學診斷[10]；同時還可在內(nèi)鏡直視下探查整個胸膜腔，準確判斷胸膜粘連程度，使組織病理診斷結(jié)果更加可靠。另外，有經(jīng)驗的醫(yī)師能夠直接根據(jù)鏡下的胸膜表現(xiàn)判斷是否為結(jié)核性胸膜炎，與病理檢查結(jié)果高度符合[16]。但內(nèi)科胸腔鏡檢查為有創(chuàng)性操作，且部分醫(yī)院因條件有限不能實施而使胸腔鏡診斷不足。故若能在未行胸腔鏡檢查前，通過臨床實驗室檢測指標來判斷是否存在胸膜粘連，對結(jié)核性胸膜炎治療及預后判斷有著重要的意義。

既往的研究提示，結(jié)核性胸膜炎胸膜增厚粘連主要與患者的年齡、病程及胸膜炎癥的嚴重程度有關(guān)[17]，但缺乏早期預測胸膜增厚、粘連的客觀指標的研究。既往研究已證實胸腔積液中檢測到的ADA對診斷結(jié)核性胸腔積液有重要價值[18]。ADA在T淋巴細胞中含量最高，其活性水平與T淋巴細胞的數(shù)量及活性相關(guān)，可間接反映局部細胞的免疫狀態(tài)。結(jié)核病是由T淋巴細胞介導的細胞免疫應答，故ADA活性在結(jié)核性滲出液中可升高。有研究表明，在結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，測量胸膜結(jié)核的ADA是廉價、微創(chuàng)、快速的試驗，對于疑似胸膜結(jié)核的患者，ADA檢測是其他診斷工具的首選篩查方法[19-20]。2008年一項Meta分析的數(shù)據(jù)顯示，ADA診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度和特異度分別高達92%和90%[21]，但ADA水平是否與胸膜粘連的嚴重程度密切相關(guān)暫無研究報道。本研究結(jié)果提示，胸膜粘連組患者胸腔積液中ADA水平明顯高于無胸膜粘連組，差異有統(tǒng)計學意義；粘連組ADA的cut-off值為62.85 U/L時，是區(qū)別結(jié)核性胸膜炎粘連與無粘連最佳的敏感度和特異度，提示ADA水平是結(jié)核性胸膜炎胸膜粘連的獨立危險因素。但是否ADA值與胸膜粘連程度動態(tài)相關(guān)，還有待進一步臨床證實。

有文獻報道，胸腔積液中有核細胞≥500×106/L及LDH≥1000 IU/L均提示胸膜的炎癥反應較重；且LDH≥1000 IU/L的胸腔積液性質(zhì)多為膿性，是胸膜炎癥反應、增厚的因素之一[22]。本研究結(jié)果顯示，胸膜粘連組患者胸腔積液中LDH水平也明顯高于無胸膜粘連組，提示胸腔積液中LDH水平增高與結(jié)核性胸膜炎局部嚴重炎癥反應有關(guān)，且當LDH cut-off值超過393.50 U/L時需警惕胸膜粘連。存在胸膜粘連的結(jié)核性胸膜炎患者治療難度大、療程長，而胸腔積液ADA、LDH與胸膜粘連嚴重程度有關(guān)，故可根據(jù)ADA或LDH水平評估患者預后及療效。

ELISPOT技術(shù)通過使用特異性抗原誘導免疫細胞分泌特異性IFN-γ水平檢測外周血或胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌，為結(jié)核感染提供新的特異性診斷方法，國外已廣泛開展全血T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗(QuantiFERON-TB)、分離后的PBMC-T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗(T-SPOT.TB)用于結(jié)核感染的診斷[23]，目前使用最多的免疫學檢測方法是結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-γELISOPT技術(shù)(IGRA技術(shù))[24]。但2015年安蕾等[25]分析了20份(1085例)全血和14份(727例)胸腔積液的檢測結(jié)果，匯總二者的敏感度和特異度分別為77%和71%、72%和78%，提示無論是在全血還是胸腔積液中單獨使用IGRA檢測，對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值均存在一定的局限性。但既往未見IGRA技術(shù)與結(jié)核性胸膜炎嚴重程度動態(tài)變化是否存在相關(guān)性的報道。本研究顯示，胸膜粘連嚴重程度對結(jié)核免疫ELISPOT斑點數(shù)結(jié)果無影響。

在先前的臨床診治過程中，結(jié)核性胸膜炎胸腔積液患者根據(jù)胸腔積液吸收情況將治療轉(zhuǎn)歸分為[26]：痊愈(胸腔積液完全吸收)、胸膜增厚(胸腔積液吸收，但胸膜增厚粘連)和包裹(胸腔積液未完全吸收，胸膜增厚粘連)。積極控制胸膜炎癥、減少滲出、清除胸腔積液、促進胸腔積液吸收，以及減少或減輕胸膜增厚和并發(fā)癥的發(fā)生是結(jié)核性胸膜炎的治療目的。早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎胸膜粘連可能，盡早、規(guī)律、聯(lián)合抗結(jié)核藥物治療可控制胸膜腔內(nèi)炎癥，減輕胸膜粘連。有研究報道，胸腔內(nèi)注射尿激酶可直接激活纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，達到溶解和裂解纖維蛋白及纖維分隔、清除胸膜粘連、降低胸腔積液的黏稠度，是保證胸腔積液引流通暢、預防胸膜增厚的可操作方法。

本次研究尚存在不足之處，既往有文獻提示結(jié)核性滲出性胸膜炎發(fā)生胸膜粘連與性別、族別、年齡、發(fā)病后就診時間、胸腔積液中細胞計數(shù)的多少、抽取胸腔積液與否，以及抽放胸腔積液次數(shù)等也有一定的關(guān)系[27]；但本次研究并未對這些因素深入研究，提醒臨床醫(yī)師仍應全面考慮這些因素的影響，提高警惕，盡早采取相應的干預措施。

綜上所述，雖然內(nèi)科胸腔鏡下判斷胸膜粘連程度直接且準確，但在條件有限、無法或因其他因素不能操作內(nèi)科胸腔鏡檢查情況下，胸腔積液中ADA、LDH水平可早期提示胸膜粘連嚴重程度，臨床應提高防范意識，采取相應的診治措施預防及治療胸膜粘連及胸膜增厚，以提高臨床治愈率，改善患者生活質(zhì)量。