逯瑩瑩 ，劉鵬，孫景珠 ，劉麗波，李春 ，

(1,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030；2,黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150030；3,泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東泰安271000)

0 引言

母乳中富含多種保護(hù)新生兒的物質(zhì)，如細(xì)胞、免疫球蛋白、先天性糖蛋白、生物活性肽、抗體、糖脂、游離脂肪酸、細(xì)胞因子和趨化因子、低聚糖[1]。其中，母乳低聚糖是一類復(fù)合糖，由單糖通過糖苷鍵連接而成，分為普通低聚糖和功能性低聚糖。HMO s的含量和組成在女性之間變化很大[2]，因為HMO s的組成與多種生理參數(shù)有關(guān)，包括哺乳母親的分泌型和Lewis血型狀態(tài)。HMO s在人乳中含量極高，一般認(rèn)為乳汁中HMO含量≥4g/L[3-5]。成熟的人乳含有5～20 g/L的低聚糖復(fù)合物，比牛奶高約20倍[6]。為了適應(yīng)成長中孩子的需要，牛奶中的低聚糖在泌乳階段也有所不同，初乳中HMO含量較高，在泌乳過程中有所下降，并受到母親飲食的影響[7]。

1 母乳低聚糖的結(jié)構(gòu)

母乳中HMO s的具體結(jié)構(gòu)不同，但都由5種單糖結(jié)構(gòu)單元組成，即D-葡萄糖（D-glucose，Glc），D-半乳糖（D-galactose，Gal），N-乙酰葡糖胺（GlcNAc），L-巖藻糖（Fuc）和N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）。所有HMO s分子在還原末端有一個乳糖殘基（Galβ1-4G lc），其可以通過兩種不同的二糖，即Ⅰ型（半乳糖β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖，Galβ1-3G lcNAc）或Ⅱ型（N-乙酰氨基乳糖，Galβ1-4G lcNAc），以β-1,3或β-1,6鍵連接延伸，獲得四個核心結(jié)構(gòu)－－乳酰-N-四糖（lacto-N-tetrose，LN T）、乳酰-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LN nT）、乳酰-N-六糖（lacto-N-hexaose，LNH）和 乳 酰 -N-新 六 糖（lacto-N-neohexaose，LNnH），如圖1所示。乳糖通過α1-2或α1-3巖藻糖基化和α2-3或α2-6唾液酸化的末端能夠產(chǎn)生4種低聚糖，分別為：2'-巖藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose，2'-FL）、3-巖藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）、3'-唾液酸乳糖（3'-sialyllactose，3'-SL）和6'-唾液酸乳糖（6'-sialyllactose，6'-SL）[8]。

圖1 母乳低聚糖的4個核心結(jié)構(gòu)

Kobata等人發(fā)現(xiàn)了4種新型核心低聚糖：LNO、LN nO、pLNH和p LN nH。后來有人報道了其他四個核心低聚糖（LND、LN nD、iLNO和pLNO）的結(jié)構(gòu)。因此，目前一共發(fā)現(xiàn)了HMO的13個核心單元，如表1所示[9-11]。這13種核心寡糖通過巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的作用進(jìn)一步延伸成巖藻糖基化和唾液酸化的寡糖。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100余種低聚糖結(jié)構(gòu)[12]，Ninonuevo等人利用微流控高效液相色譜（HPLC）芯片質(zhì)譜法檢測到約200種低聚糖[13]。

在線性序列末端的Gal上不發(fā)生糖鏈的分支，只有內(nèi)部Gal殘基上的6-羥基處才進(jìn)行分支。半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（β1-3 GalT或β1-4 GalT）可以在G lcNAc的3位或4位上以β連接添加Gal,因此G lcNAc不在末端出現(xiàn)。負(fù)責(zé)向乳糖胺單位（Gal-G lcNAc-R）添加G lcNAc和促進(jìn)聚糖延伸的酶只作用于Ⅱ型二糖受體，不會延伸Ⅰ型二糖受體。因此，Ⅰ型二糖是HMO中的主要末端決定簇[14]。

因為Sia含有一個羧基，它向HMO引入負(fù)電荷，所以依據(jù)分子中是否含有N eu5Ac，可以將HMO s分為唾液酸化（酸性）或非唾液酸化（中性）HMO。酸性和中性寡糖均可以被巖藻糖化。巖藻糖的添加至少由三種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FuT1、FuT 2、FuT 3）控制，其中FuT 2催化α1-2-連接的Fuc加入HMO主鏈，F(xiàn)uT 3則催化α1-3-或α1-4-的連接。HMO巖藻糖基化與分泌類型和Lewis血型抗原有關(guān)，根據(jù)活性FUT 2和FUT 3酶的表達(dá)，女性可以分為四組（Se±/Le±）：⑴分泌型Le陽性（FUT 2有效，F(xiàn)UT 3有效），⑵非分泌型Le陽性（FUT 2無效，F(xiàn)UT 3有效），⑶分泌型Le陰性（FUT 2有效，F(xiàn)UT3無效）和⑷非分泌型Le陰性FUT 2和FUT3無效）[15]。分泌者婦女的乳汁含有高濃度的α1-2巖藻糖化HMO s，例如，2'-巖藻糖基乳糖（2'FL）和乳糖-N-巖藻五糖1（LN FP1）。而非分泌者不表達(dá)活躍的FUT 2，非分泌者女性的乳汁缺乏α1-2巖藻糖基化的HMO s。

表1 母乳低聚糖的13個核心單元

2 母乳低聚糖的作用

HM O s在新生兒發(fā)育中起著獨特而重要的作用。在新生兒發(fā)育的頭幾個月內(nèi)，腸道微生物群的變化主要受母乳的影響。由母乳喂養(yǎng)誘導(dǎo)的腸道菌群有助于出生后胃腸道和免疫系統(tǒng)的發(fā)育。HMO s對嬰兒健康有許多有益的作用，如促進(jìn)雙歧桿菌和其他能夠利用低聚糖的微生物的生長，使腸道中的雙歧桿菌得以富集，從而解決腸易激綜合征和炎癥性腸病、預(yù)防和控制腹瀉、增加碳水化合物聚合物的消化效率、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、阻礙致病菌的定殖，還可以指導(dǎo)特定宿主糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，這些特定宿主糖基轉(zhuǎn)移酶又重構(gòu)呈遞給微生物的上皮糖鏈表位[16-18]。低聚糖不僅提供對病原體的保護(hù)或?qū)γ庖呦到y(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生影響，還影響新生兒的認(rèn)知功能。除了排泄到尿液外，它們也出現(xiàn)在嬰兒的血液中[19]，間接證明了王兵等人的發(fā)現(xiàn)，即唾液酸在腦發(fā)育中起重要作用[20]。

HMO s的主要作用被歸為三大類：一是作為益生元，改變微生物的組成和功能以使宿主受益；二是作為抗黏附劑或受體誘餌，阻礙病原體在胃腸道（Gastrointestinal,GI）內(nèi)定殖；三是作為免疫調(diào)節(jié)劑，對GI上皮直接作用，調(diào)節(jié)宿主對GI微生物的免疫應(yīng)答。

2.1 作為益生元

作為益生元，HMO s可以選擇性刺激內(nèi)源性微生物群的活性，促進(jìn)雙歧桿菌和乳桿菌的增殖[21]，抑制有害細(xì)菌生長，改善腸道微環(huán)境，維護(hù)機體健康狀態(tài)。研究表明，可以代謝巖藻糖基化或唾液酸化HMO的細(xì)菌具有選擇性定殖優(yōu)勢[22-23]。大多數(shù)擬桿菌屬和一些梭菌屬也具有有效利用HMO s所必需的基因組[24]。微生物代謝這些益生元的方式差異，導(dǎo)致不同的短鏈脂肪酸（SCFAs）和乳酸鹽的產(chǎn)生，進(jìn)而造成不同的細(xì)菌生長[25]。母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道微生物群通常以雙歧桿菌為主導(dǎo)，所以腸道微生物多樣性比其他發(fā)育階段低。在嬰兒期，定殖腸道微生物群的組成受母乳低聚糖的影響[26]。

只有極少數(shù)細(xì)菌能夠降解整套HMO s[27]。其他細(xì)菌可能只能利用有限的一組HMO s或更復(fù)雜的HMO s上的特定表位。例如，具有某種巖藻糖苷酶的細(xì)菌可能能夠利用Fuc，但不能利用Sia。有些細(xì)菌只有在其他細(xì)菌從骨架上去除Fuc或Sia之后才能夠利用HMO s。因此不同微生物對HMO s的連續(xù)降解有待進(jìn)一步闡明。

2.2 作為抗黏附劑或受體誘餌

病毒或細(xì)菌病原體（如H IV、肺炎鏈球菌、腸致病性大腸桿菌、霍亂弧菌或空腸彎曲桿菌）通過靶向糖基化結(jié)構(gòu)如糖脂或糖蛋白而粘附于宿主上皮細(xì)胞[28]，并且在一些情況下侵入并引起疾病。此時，HMO s可以作為抗黏附劑占據(jù)宿主細(xì)胞表面的結(jié)合位點，阻斷病原體與上皮細(xì)胞結(jié)合，未結(jié)合的病原體不能再附著于細(xì)胞表面并被洗掉而不會導(dǎo)致疾病。因此，與配方喂養(yǎng)的嬰兒相比母乳喂養(yǎng)的嬰兒中這些病毒感染的發(fā)病率降低[29]。作為受體“誘餌”，2'-FL，3-FL或乳酰-N-巖藻五糖（lacto-N-fucopentaoseⅠ，LNFPⅠ）可以與病原體結(jié)合[30-32]，隨后結(jié)合物便從上皮表面脫落，并通過胃腸蠕動清除。

HMO s還能阻止溶組織內(nèi)阿米巴的附著。溶組織內(nèi)阿米巴表達(dá)凝集素，這種表面凝集素是參與溶組織內(nèi)阿米巴與腸上皮細(xì)胞黏附的主要毒力因子，也參與隨后對這些細(xì)胞的殺傷和吞噬作用，引起阿米巴痢疾或阿米巴結(jié)腸炎。HMO s阻斷凝集素以及阻止附著、殺傷和吞噬作用，并能夠挽救受損的上皮細(xì)胞[33]。

2.3 作為免疫調(diào)節(jié)劑

HMO s不僅可以直接影響微生物，還可以通過改變宿主細(xì)胞反應(yīng)間接影響微生物。體外實驗和動物模型實驗的數(shù)據(jù)表明，HMO s直接與胃腸道內(nèi)的上皮細(xì)胞以及位于黏膜免疫組織和循環(huán)中的免疫細(xì)胞相互作用，從而調(diào)節(jié)免疫功能[34]。嬰兒由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟而特別敏感，極易感染流感病毒。而母乳低聚糖結(jié)構(gòu)恰巧能充當(dāng)受體模擬物，從而降低嬰兒感染流感病毒的風(fēng)險。HMO s不僅可以結(jié)合病原體，還能抑制由腸毒素大腸桿菌（ETEC）、尿道致病性大腸桿菌（UPEC）和黏附侵襲性大腸桿菌（AIEC）的Ⅰ型菌毛感染引起的炎癥。Bode等發(fā)現(xiàn)HMO確實減少了尿道致病性大腸桿菌（UPEC）的侵襲，但不能作為減少UPEC與上皮細(xì)胞黏附的抗粘連劑。HMO s與上皮細(xì)胞相互作用并使其更能抵抗UPEC攻擊，當(dāng)UPEC試圖破壞它們時，HM O s強烈抑制凋亡途徑的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞不響應(yīng)。這種作用具有高度的結(jié)構(gòu)依賴性，只有唾液酸化的HMO s如3'-唾液乳糖才有效[35]。

一些目標(biāo)低聚糖具有降低壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）風(fēng)險的潛力，特別是在小鼠和人類研究中，二唾液酸乳糖-N-四糖（disiayl-lacto-N-tetraose，DSLNT）和包含α-1,2-巖藻糖鍵的低聚糖（例如2'-FL）有助于減少NEC或GI炎癥[36]。來自人乳的分泌型和Lewis型抗原可以阻斷諾如病毒（N oVs）和同源受體結(jié)合，這說明與Lewis型抗原結(jié)構(gòu)相似的低聚糖也能夠預(yù)防諾如病毒引起的腸胃炎。雖然HMO s不能顯著預(yù)防輪狀病毒（RV）感染的發(fā)作，但通過操縱內(nèi)源性微生物群和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，可減少仔豬模型腹瀉的持續(xù)時間[37]。HMO可以作為一種輔助治療藥物來緩解炎癥性腸病（In flam matory bowel disease,IBD），特別是那些含有α-1，2-巖藻糖的藥物。IBD主要是由于表面巖藻糖基化的缺乏，使宿主對胃腸道炎癥和微生物失調(diào)的敏感性增加而引起的。

3 母乳低聚糖的合成

由于自然界不能為科學(xué)研究或臨床應(yīng)用提供足夠數(shù)量的此類功能性碳水化合物，因此開發(fā)用于改善此類碳水化合物生產(chǎn)的新技術(shù)已成為糖類科學(xué)領(lǐng)域的新挑戰(zhàn)。人們認(rèn)為每個HMO都有其特定的功能，但只有定義其結(jié)構(gòu)、獲得同質(zhì)的HMO，才能闡明它們的特定功能作用。在人乳中發(fā)現(xiàn)的二唾液酸基乳糖基-N-四糖（DSLNT）可以預(yù)防新生大鼠的壞死性小腸結(jié)腸炎。這項研究取得成功的關(guān)鍵是獲得DSLN T的合理均質(zhì)樣品，這證明了同質(zhì)的、結(jié)構(gòu)上界定的HMO的價值和必要性，并且表明獲得這種碳水化合物含量有可能對糖類生物學(xué)的研究提供新的思路。

為了深入準(zhǔn)確地闡明特定HMO的生物功能，需要開發(fā)一種通用的合成方法，使人們能夠快速模擬整個HMO結(jié)構(gòu)空間。因為Ⅰ型和Ⅱ型核心能夠被巖藻糖、唾液酸和硫酸鹽殘基取代，因此該方法必須適應(yīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)變化。此外，這種方法最好還能合成各種確定的Lewis抗原結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)HMO s和Lewis抗原之間的比較研究。

全面闡明HMO的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系在原則上要求獲得所有HMO的內(nèi)容。化學(xué)合成、酶促合成、生物工程合成方法為完全獲取HMO提供了可能。

3.1 化學(xué)合成

低聚糖Ⅰ型和Ⅱ型核心的合成需要：在3'-位（Gal殘基的3位）和2位(還原端GLC殘基的2位)上分化的乳糖二糖、完全分化的G lcNAc單元和完全分化的Gal單元以及修飾HMO核的FUC和Neu5Ac單糖組分。此外，所有這五個結(jié)構(gòu)單元也可用于合成Lewis抗原核心序列。

結(jié)構(gòu)單元的合成路線應(yīng)該具有可擴展性和成本效益，特別著重于最小化反應(yīng)時間和體積、最小化色譜分離和確定結(jié)晶中間體。Per-O-乙?；ㄊ且环N普遍使用的方法，用于可擴展生產(chǎn)穩(wěn)定的結(jié)晶早期中間體。Lac組塊過程通過穩(wěn)定的1,2-芐基正聚酯中間體進(jìn)行，并通過2-位鄰接基團(tuán)參與，使其成為單一的還原端異常體(β-O-芐基)，這對縮短下游中間體的分離和表征很重要。G lcNAc結(jié)構(gòu)塊包括一個烯丙基糖苷，隨后作為三氯乙酰亞胺酯供體被去除和活化；一個2-N-三氟乙酰基，用于隨后的β-偶聯(lián)產(chǎn)物；一個4,6-乙酰丙酮基，它使G lcNAc單元的3-、4-和6-位置得以分化。Gal單元在HMO中具有高度取代性，是實現(xiàn)HMO多樣性的關(guān)鍵部件，因此多功能結(jié)構(gòu)單元需要多個正交保護(hù)基團(tuán)的完全區(qū)分，Gal構(gòu)件的設(shè)計包括在每個位置上具有不同反應(yīng)活性的保護(hù)組。Fuc和N eu5Ac單糖構(gòu)建模塊作為兩個相對簡單的末端結(jié)構(gòu)，不進(jìn)行進(jìn)一步的替代，可以在每個位置上以相同的組群統(tǒng)一保護(hù)。

從還原端Lac二糖開始，可以通過多種方法組裝HMO聚糖，包括（1）將單糖結(jié)構(gòu)單元反復(fù)添加至生長中的寡糖鏈；（2）裝配線性LacNAc-Lac或neo-Lac-NAc-Lac核心，然后加入Fuc和N eu5Ac殘基；（3）添加到Lac二糖中的寡糖嵌段（例如Lex，SLex，Ley，Lea寡糖）的預(yù)裝配。對于合成簡單的HMO s如巖藻糖基乳糖或唾液酸乳糖，將Fuc或Neu5Ac迭代添加到Lac二糖是優(yōu)選的方法。相反，用于合成復(fù)合HMO s的最常用選擇是向Lac二糖添加預(yù)組裝的寡糖。

眾多的保護(hù)和脫保護(hù)步驟、大量有毒的試劑和有機溶劑、苛刻的反應(yīng)條件等因素都使得純化學(xué)合成耗時，且會導(dǎo)致相對低的產(chǎn)品收率，這總體上不具有成本效益。盡管已經(jīng)開發(fā)了諸如固相低聚糖合成等方法來改進(jìn)，但毒性試劑的使用仍限制了化學(xué)合成方法在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

3.2 酶促合成

雖然HMO是復(fù)雜的，但共同的結(jié)構(gòu)特征使化學(xué)酶路線得以開發(fā)，使用相對有限的酶組合來介導(dǎo)糖基供體與受體的連接。酶促反應(yīng)具有完全的化學(xué)選擇性和立體選擇性，通常具有較高的區(qū)域選擇性和效率，能夠在溫和的水環(huán)境中沒有保護(hù)基團(tuán)的情況下在底物上進(jìn)行反應(yīng)。在許多情況下，酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可以代替化學(xué)合成方案中的許多化學(xué)反應(yīng)。進(jìn)行特定轉(zhuǎn)化所需的各種酶可以在多酶系統(tǒng)中組合以重述生物合成途徑，從而能夠在毫克-千克的規(guī)模合成復(fù)雜的低聚糖。

酶促合成最常用的是在底物、輔助性因子和供體存在下合成的異種表達(dá)和純化的酶。將酶固定在固體表面載體或珠子上有利于產(chǎn)物純化并使得酶得以再循環(huán)。目標(biāo)低聚糖的分離可以通過陰離子交換柱離心去除相對簡單的蛋白質(zhì)，以螯合核苷酸材料。如果轉(zhuǎn)化不完全，則需要在活性炭、離子交換樹脂或聚丙烯酰胺柱上進(jìn)行后續(xù)色譜分離，以將受體與糖基化物質(zhì)分離。

用于合成HMO s的特定酶是糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）特別是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GalTs）、N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶（G lcNAcTs）、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FucTs）、唾液酸轉(zhuǎn)移酶（STs）和糖苷水解酶（GHs）特別是β-半乳糖苷酶和唾液酸酶，以及被稱為糖苷合成酶（GSs）的被修飾的GH s。表2列出了主要酶的利弊。酶促反應(yīng)所需的酶可以通過選擇性沉淀、反復(fù)純化或重組技術(shù)從宿主中獲得，這些寄主可能是哺乳動物、昆蟲或微生物。

表2 酶促反應(yīng)中主要酶的利弊

3.2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）

GTs通過將糖基從活化的供體底物轉(zhuǎn)移到受體底物上來催化二糖、寡糖或多糖的合成[38-40]。用于GT的糖基供體可以是活化的核苷酸糖（Leloir型）或單磷酸糖（非Leloir型）供體。哺乳動物GTS通常是具有催化作用的整體膜糖蛋白，其催化中心位于高爾基體的管腔中。這種膜結(jié)合常常導(dǎo)致分離困難，需要用去污劑溶解以確保穩(wěn)定性并防止變性和聚集。由于缺乏類似的細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)，重組哺乳動物GT常常在微生物宿主物種如大腸桿菌中表達(dá)不佳，或者由于翻譯后修飾或折疊過程期間氧化環(huán)境的差異而表達(dá)為無活性的酶。

在細(xì)菌中，GT參與細(xì)胞表面糖類如脂寡糖（LOS）和脂多糖（LPS）的生物合成。這些糖有時與哺乳動物聚糖具有很高的相似性，包括LN T，LN nT，globotriose，巖藻糖化結(jié)構(gòu)如Lex和Lea，以及唾液酸化基序如sLex[41]。與哺乳動物GT相反，細(xì)菌GT不被糖基化，因此可以更容易地以重組形式制備。迄今為止，主要來自細(xì)菌的β1,3-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶、β1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、β1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、α1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α1,4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶已被用于酶促合成HMO。

3.2.2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FucTs）

來自幽門螺旋桿菌的FucTs使用核苷酸活化的糖——GDP-β-Lfucose（GDP-Fuc）作為供體，在微生物脂多糖中的巖藻糖基化過程中發(fā)揮作用，這一過程多次重復(fù)N-乙酰乳糖胺（LacNAc）或乳糖-N-二糖（LNB）單元。FucTs對乳糖的親和力較低，特別是來自螺桿菌菌株的1,3-FucTs（例如FutA），這使得2'-FL或3-FL的生產(chǎn)效率降低。最近，通過系統(tǒng)性缺失FutA的C端（僅留下一個七肽重復(fù)序列）和優(yōu)化密碼子（使溶解度增加）已經(jīng)克服了該缺點。選擇四倍體突變體，其顯示乳糖作為受體的活性提高15倍（LacNAc活性升高約8倍），導(dǎo)致3-FL或Lewis X（Lex）的產(chǎn)量和生產(chǎn)力提高[42]。

以GDP-α-D-甘露糖為起始化合物，重組大腸桿菌GM D（GDP-D-甘露糖4,6-脫水酶）和WcaG（NADPH依賴性GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖3,5-差向異構(gòu)酶-4-還原酶）最終得到GDP-Fuc，產(chǎn)率為78%。然后使用重組α1,2-FucT（從幽門螺桿菌中克隆FucT 2）將GDP-Fuc轉(zhuǎn)移到乳糖上，得到2'-巖藻糖基乳糖。經(jīng)陰離子交換色譜和凝膠過濾分離2'-FL，產(chǎn)率為65%。由于GDP-Fuc對GMD的強烈反饋抑制，一鍋反應(yīng)是不可能的[43]。

3.2.3 唾液酸轉(zhuǎn)移酶（STs）

唾液酸化的低聚糖可以通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST）、唾液酸酶和轉(zhuǎn)唾液酸酶產(chǎn)生，主要的唾液酸化HMO是3'-和6'-唾液酸乳糖（分別為3'-SL和6'-SL），二者都具有生物活性[44]。α2,3-和α2,6-ST通過將唾液酸（N eu5Ac）從活化的核苷酸糖供體（例如CM PN eu5Ac）轉(zhuǎn)移至受體低聚糖來修飾HM O。受體通常以半乳糖苷、N-乙酰半乳糖胺或其他唾液酸為終止信號[45]。

微生物來源的STs比哺乳動物的STs有更廣的底物來源。哺乳動物STs是高爾基體中的膜蛋白，因此不適合用于生物催化[46]。在各種致病性細(xì)菌中已檢測到ST，例如奈瑟球菌、彎曲桿菌、巴斯德氏菌和嗜血桿菌；最近還有一些與人類致病性無直接關(guān)系的細(xì)菌（如發(fā)光桿菌），已成為ST的供體[47]，重組基因已被用于生物催化目的。來源于細(xì)菌的α2,3-ST（來自腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟氏球菌）和α2,6-ST（來自發(fā)光桿菌）是第一種用于酶促合成唾液酸苷的重組ST。為了降低CM P-N eu5Ac-的成本，開發(fā)了一種多酶原位再生系統(tǒng)[48]。

現(xiàn)階段，酶促合成依然面臨許多挑戰(zhàn)：一、必需的酶不易獲得。二、糖核苷酸供體昂貴。三、酶的反應(yīng)受到酶的固有生物學(xué)能力的限制，包括酶的穩(wěn)定性、催化轉(zhuǎn)化率低、底物和受體的耐受性以及產(chǎn)品、底物和釋放的核苷磷酸酯或焦磷酸酯對產(chǎn)物的抑制。

3.3 生物工程合成

HMO合成的主要問題有：一、單糖的來源：N-乙酰葡糖胺、L-巖藻糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸等單糖難以獲得。二、將單糖特異性組裝成寡糖：需要特定的酶如糖基轉(zhuǎn)移酶來完成，但是這些酶需要比單糖更加罕見和昂貴的核苷酸糖。為了解決這些問題，多年來制定了一些策略。

首先在體內(nèi)合成所需的核苷酸糖，然后通過生物催化組裝HMO s。Prieto和同事提出的解決方案是讓酵母如無名假絲酵母合成核苷酸糖，將這些酵母與表達(dá)特定轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌合并，這些轉(zhuǎn)移酶催化合成HMO s。該方法產(chǎn)生了通過重組微生物獲得的第一批HMO，例如LN T-2（30g/L）、LN nT（13g/L）和LNF-III（4g/L）。接著將上述微生物宿主所用的酶和途徑組合成一個單一的生產(chǎn)宿主。隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，多種生物合成途徑酶的克隆和優(yōu)化變得越來越容易，使得單細(xì)胞生產(chǎn)生物體的快速發(fā)展成為可能。新一代測序和宏基因組學(xué)對代謝工程師創(chuàng)造新型合成途徑至關(guān)重要。

4 結(jié)論

總之，與其他大多數(shù)哺乳動物的乳汁不同，人乳含有非常高濃度的低聚糖。不同結(jié)構(gòu)的HMO可能具有不同的功能，想要全面說明低聚糖結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，在原則上需要獲得所有HMO的結(jié)構(gòu)信息。低聚糖生產(chǎn)、分離和純化技術(shù)的進(jìn)步為研究HMO的許多潛在功能提供了機會。HMO混合物和單個HMO s已經(jīng)以前所未有的數(shù)量出現(xiàn)，使我們能夠評估它們的代謝途徑、功效和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。一般采用化學(xué)合成、酶促合成、生物工程合成的方法獲得HMO。

酶促合成HMO提供了罕見的HMO和化學(xué)衍生物，但在大多數(shù)情況下產(chǎn)率低，已發(fā)表的文章中產(chǎn)品多以毫克量，少數(shù)例子顯示為克量。因此，如何提高產(chǎn)品的規(guī)模以滿足食品工業(yè)生產(chǎn)食品添加劑的經(jīng)濟要求是值得思考的問題[49]。此外，合成某些HMO前體的化學(xué)方法仍然是必要的，因為合成HMO所需的糖基轉(zhuǎn)移酶有時缺乏足夠的活性或特性。最好的、最經(jīng)濟的合成方案可能是化學(xué)合成LacNAc-Lac或neo-LacNAc-Lac主鏈，然后用具有良好特性的重組酶對N eu5Ac和Fuc殘基進(jìn)行酶催化的取代。一旦一種特定的HMO被確定為一種潛在的營養(yǎng)或醫(yī)藥產(chǎn)品，開發(fā)一種工程細(xì)菌或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)就可以提供經(jīng)濟的工業(yè)化途徑。目前，人們還在為建立具有不同鏈長、分支模式和巖藻糖基化或唾液酸化低聚糖的HMO庫而不懈努力。