呂 昂，范 新，蘇 倩，俞文英，余陳歡

(1.杭州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 310006；2.杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 310008；3.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州 310013)

車前草又名車前、豬耳草、車輪菜、錢串草等，為車前科植物車前PlantagoasiaticaL.或平車前PlantagodepressaWilld.的干燥全草。作為臨床常用中藥，車前草具有清熱利尿、滲濕通淋、止咳化痰、涼血、解毒等功效，用于熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕泄瀉、痰熱咳嗽、吐血衄血及癰腫瘡毒等[1-2]。

車前草的化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜、黃酮、苯乙醇苷、多糖等[3-5]。文獻(xiàn)報(bào)道車前草中的苯乙醇苷類成分(如大車前苷)具有抑制糖基最終產(chǎn)物形成[6]、抗氧化[6]、抗炎[7]、解痙[8]等作用，與車前草的功效相吻合，同時(shí)，大車前苷為車前草的專屬性成分，在車前草中含量較高，為車前草質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測定車前草中大車前苷的含量[1]，并對影響提取車前草的因素進(jìn)行了考察，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選出最佳提取工藝，為將其研發(fā)為中藥新藥提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀(配備LC-20AT泵、柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器、SIL-20AC自動進(jìn)樣器、LCsolution色譜工作站，日本島津公司)，Dikma微孔濾膜(0.45 μm)、Sartorius BT125s型電子分析天平(德國賽多利斯公司)，BUCHI R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)，DK-S22型恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Beckman Coulter 64R高速離心機(jī)(貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司)。

1.2 試藥

大車前苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，批號：20141202，南京春秋生物工程有限公司)，車前草(批號：150301，浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司)，乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(德國Merck公司)，水為純化水，磷酸等其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1色譜條件

色譜柱：DiamonsilTMC18分析柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(16∶84)；檢測波長：330 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μl；理論塔板數(shù)以大車前苷峰計(jì)不低于3 000，大車前苷與相鄰組分色譜峰分離度大于1.5；該色譜條件下的對照品與樣品色譜圖見圖1。

2.1.2對照品溶液的配制

精密稱取大車前苷對照品12.51 mg，置50 ml棕色容量瓶中，加60%甲醇溶解至刻度，配成濃度為250.2 μg/ml的對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備

稱取車前草飲片10 g，置圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇，在恒溫水浴槽中加熱回流提取3次，每次2 h，趁熱過濾，合并提取液，并定容到一定體積，作為供試品溶液。

2.1.4線性關(guān)系考察

分別量取適量對照品儲備液，加60%甲醇稀釋成濃度分別為12.51、25.02、50.04、75.06、100.08、125.10 μg/ml的對照品溶液，搖勻，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/ml)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=15 543X+52 895(r=0.999 6)，結(jié)果表明，大車前苷在12.51～125.10 μg/ml濃度范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系。

2.1.5精密度試驗(yàn)

取濃度為75.06 μg/ml的大車前苷對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算得大車前苷平均峰面積的RSD為0.35%，表明該儀器精密度良好。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批車前草，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算大車前苷含量，平均值為12.26 mg/g，RSD為2.56%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批車前草飲片，制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，計(jì)算其峰面積的RSD為0.86%，表明該樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知大車前苷含量的樣品6份，按含量的1∶1加入對照品，按照上述供試品溶液的制備方法制備，測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 大車前苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

結(jié)果表明，平均回收率為98.57%，RSD為1.45%，表明該方法可靠性良好。

2.1.9樣品的測定及浸膏得率計(jì)算

取適量車前草粉末，精密稱定，制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μl，按“2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件測定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中大車前苷的含量。同時(shí)，精密吸取樣品溶液30 ml于恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，放入烘箱中烘干至恒重，計(jì)算浸膏得率。

2.2 提取工藝考察

2.2.1提取次數(shù)的確定

稱取車前草飲片10 g，至圓底燒瓶中，加10倍量70%乙醇，在恒溫水浴槽中加熱回流，提取4次，每次2 h，考察提取次數(shù)對大車前苷含量的影響，結(jié)果見表2。

表2 提取次數(shù)對車前草中大車前苷含量的影響

由表2可知，4次提取后，大車前苷基本提取完全，第3次提取得到的大車前苷已經(jīng)很低，以提取4次得到的所有大車前苷的量作為大車前苷的總含量時(shí)，提取2次的大車前苷提取量為：10.95 mg/g，提取率達(dá)87.5%。從工業(yè)化生產(chǎn)成本考慮，提取2次更為經(jīng)濟(jì)，因此選擇提取2次即可。

2.2.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

采用L9(34)重復(fù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以大車前苷轉(zhuǎn)移率和浸膏得率為評價(jià)指標(biāo)，考察乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取時(shí)間(C)3種因素對提取率的影響，每種因素按照3個(gè)水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，因素水平詳見表3。

表3 L9(34)因素水平表

按正交表安排試驗(yàn)，稱取中藥車前草飲片10 g，將稱好的藥材置于圓底燒瓶中，加溶劑，在恒溫水浴槽里加熱回流提取，趁熱過濾提取液，并定容到一定體積，得各樣品溶液，取樣，按照“2.1”項(xiàng)所述試驗(yàn)方法測定大車前苷轉(zhuǎn)移率和浸膏得率，并對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表4～5。

表4 正交試驗(yàn)方案和結(jié)果

表5 大車前苷轉(zhuǎn)移率、浸膏得率方差分析表

F0.05(2,2)=19.00

由上述直觀分析和方差分析結(jié)果可知，乙醇濃度、用量和提取時(shí)間這3種因素對車前草乙醇提取物的得率以及大車前苷轉(zhuǎn)移率均有影響，其中乙醇濃度和乙醇用量的影響較為顯著。從節(jié)約成本及有效成分轉(zhuǎn)移率最大化原則考慮，選擇60%乙醇(A2)、10倍量藥材量(B3)、每次提取1 h(C1)為最佳提取條件。

2.2.3最佳工藝驗(yàn)證

取車前草藥材，用10倍藥材量的60%乙醇提取2次，每次1 h，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大車前苷轉(zhuǎn)移率分別為84.77%、85.21%、86.33%，浸膏得率分別為19.88%、21.71%、20.56%。

3 討論

3.1 HPLC條件的選擇

在液相色譜條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，比較了甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)的分離效果更優(yōu)。由于大車前苷為弱酸性化合物，在水相中加入一定量酸后，大大改善了色譜峰的拖尾。與乙腈-0.5%磷酸水溶液相比，乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相時(shí)，色譜峰的對稱性更好，拖尾因子α=1.030。在流動相比例的調(diào)整中，乙腈-0.1%甲酸水溶液從17∶83調(diào)整到16∶84時(shí)，樣品中大車前苷的分離度得到極大改善。

3.2 提取方法的選擇

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，以提取液中大車前苷的含量和提取物的得率作為考察指標(biāo)，考察了冷浸法、熱回流法、超聲提取法的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱回流法所提取的指標(biāo)性成分含量較高。在提取溶劑的選擇上，由于苯乙醇苷類極性較大，一般選取水、乙醇、甲醇等溶劑提取，考慮到車前草在水中的提取效率較低，而溶劑甲醇的成本高、毒性大，故選擇乙醇作為提取溶劑。