周中凱，趙亞麗,2，楊星月,2

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300041）

魔芋中存在大量的多糖，結(jié)構(gòu)顯示為魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）[1]。KGM具有良好的吸水性、成膜性、增稠性、可塑性、乳化性、結(jié)構(gòu)性、保水性和賦形性等多種性質(zhì)[2-3]，其獨特的流變和凝膠性使它在功能性食品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[4-5]。另外營養(yǎng)學(xué)研究表明，KGM具有良好的減肥、降脂和潤腸通便作用[6-9]。但由于KGM相對分子質(zhì)量較高、黏度大，因此在食品工業(yè)上的應(yīng)用受到限制。因此，將魔芋中的大分子降解為中小分子，如魔芋低聚糖（konjac oligosaccharides，KOS）產(chǎn)品[10]，不僅可以大大降低其黏度，還可以極大程度提高其在食品中的應(yīng)用范圍，特別是生成的低聚糖類產(chǎn)品也是活性較強(qiáng)、生理功能顯著的一類產(chǎn)品。因此本研究以低聚糖為干預(yù)原料來證實其功效。

關(guān)于魔芋低聚糖的功效已經(jīng)有了一些研究：楊艷燕等[11]研究了魔芋二糖或三糖異構(gòu)體的低聚糖對小鼠血糖能力和抗氧化能力的影響；譚揚等[12]研究了魔芋低聚糖的通便功能；陳黎等[13]研究魔芋低聚糖的降脂作用?？刂芀GM非徹底降解可獲得不同聚合度的魔芋葡甘低聚糖[14]，不同分子質(zhì)量的魔芋低聚糖其功效也有所不同。本實驗用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵制得的酶液水解鮮魔芋，得到魔芋低聚糖水溶液，將其離心、噴霧后制得魔芋低聚糖粉末，將其加入高脂飼料以研究其功效。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性健康昆明小鼠，體質(zhì)量（22±2）g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-（軍）2012-0004。

白魔芋購于陜西省安康市嵐皋縣。小鼠基礎(chǔ)飼料購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，高脂飼料配方：63.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）基礎(chǔ)飼料、15%豬油、10%蔗糖、1%膽固醇、0.2%膽酸鈉、10%蛋黃粉。干預(yù)飼料配方：60.8%基礎(chǔ)飼料、3%魔芋低聚糖、15%豬油、10%蔗糖、1%膽固醇、0.2%膽酸鈉、10%蛋黃粉。

總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物科技有限公司；動物組織總RNA提取試劑盒北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄（r e v e r s e transcription，RT）及RT-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 美國Thermo公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table1 Primer sequences used for RT-PCR

1.2 儀器與設(shè)備

Step one plus定量PCR儀 美國ABI公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS） 美國布魯克道爾頓公司；MK-3酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；智能培養(yǎng)箱 寧波賽福實驗儀器有限公司；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋天津市歐諾儀器表有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魔芋低聚糖的制備

魔芋洗凈、去皮、切片，稱質(zhì)量后用打漿機(jī)打漿制成漿液（魔芋和蒸餾水的料液比為1∶10，打漿時間30 s），將漿液裝入錐形瓶中加酶（酶活力2 509 U/mL，酶與漿液的體積比1∶100），該酶為解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵制得），將漿液放在磁力攪拌器上攪拌30～40 min直至均勻，在45 ℃條件下放入水浴搖床180 r/min振蕩4 h后，4 000 r/min離心20 min，取上清液，將上清液放入高壓滅菌鍋滅酶（121 ℃，20 min），取出冷卻至室溫后過3層粗棉布除去沉淀的纖維類物質(zhì)，收集濾液噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，出風(fēng)溫度80～90 ℃）制得粉末，收集置于干燥器中備用。魔芋低聚糖粉末外觀呈粉狀，白色，無臭無味。KOS經(jīng)過酶解、分離、精制等工序，基本脫去非多糖成分，魔芋低聚糖純度在90%以上，其他為少量單糖，基本無其他成分（如蛋白質(zhì)等成分）的檢出；經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測出魔芋低聚糖m/z為744。

1.3.2 動物實驗

飼養(yǎng)條件：溫度（2 0～2 5）℃，相對濕度50%～55%，正常采光，動物實驗符合國家《實驗動物管理條例》。

隨機(jī)將小鼠分為3 組：正常飼料組（NC）、高脂飲食組（MC）、低聚糖干預(yù)高脂飲食組（KOS），每組12 只。第1周：適應(yīng)性喂養(yǎng)，各組小鼠均進(jìn)食正常飼料；第2～5周：NC組進(jìn)食正常飼料，KOS組、MC組均進(jìn)食高脂飼料；第6～9周：NC組進(jìn)食正常飼料，KOS組進(jìn)食干預(yù)飼料，MC組進(jìn)食高脂飼料。所有小鼠均自由進(jìn)食、飲水。

1.3.3 指標(biāo)檢測

1.3.3.1 血清樣本的采集

實驗結(jié)束后，將小鼠禁食12 h后，眼球取血，血樣于室溫靜置2 h，5 000 r/min離心10 min后，取上層血清置于－80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 肝指數(shù)、體脂比的測定

小鼠處死后立即解剖，取出肝臟、脂肪，用濾紙吸干表面水分后稱其濕質(zhì)量，分別根據(jù)式（1）、（2）計算肝指數(shù)和體脂比。

1.3.3.3 血清指標(biāo)的測定

TC、TG、LDL-C、HDL-C、T-AOC、T-SOD、GSH-Px、MDA水平嚴(yán)格按照試劑盒的相關(guān)說明測定，每個樣品重復(fù)測3 次，取平均值。

1.3.4 小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的測定

小鼠總RNA提取采用動物組織總RNA提取試劑盒，用DNA酶去除基因組DNA。用Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒合成單鏈cDNA，反應(yīng)條件為37℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s并于4 ℃條件下儲存。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用Step one plus定量PCR儀進(jìn)行，20 μL反應(yīng)體系包含0.4 μmol/L前引物和后引物、1 μg cDNA、10 μL SYBR Ⅱ熒光染料和0.4 μL ROX參比熒光染料。熱循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，之后95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)34 s，交替進(jìn)行40 個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束儀器測定記錄熒光強(qiáng)度。β-actin基因作為內(nèi)參基因，mRNA相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 膳食對小鼠體質(zhì)量的影響

各組小鼠1～9 周體質(zhì)量如圖1所示，其中6～9 周為干預(yù)時間。本實驗采用兩段式喂養(yǎng)方式：2～5周建模期，以高脂飼料喂養(yǎng)小鼠（MC組小鼠和KOS組小鼠）以得到肥胖小鼠，2～5 周高脂飲食的小鼠體質(zhì)量并無顯著差異。第6周開始用KOS對高脂小鼠進(jìn)行干預(yù)。第6～9周，MC組小鼠體質(zhì)量明顯高于NC組小鼠，這說明高脂飲食可以誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量增加。而進(jìn)行KOS干預(yù)（6～9周）后，KOS組小鼠體質(zhì)量趨于平穩(wěn)，隨著時間的延長，KOS組小鼠的體質(zhì)量與MC組小鼠體質(zhì)量差異愈來愈大。這說明低聚糖干預(yù)對高脂飲食小鼠體質(zhì)量的增加有抑制作用。

圖1 各組小鼠第1～9周體質(zhì)量變化Fig.1 Body mass changes of mice during the experiment

2.2 膳食對小鼠肝指數(shù)和體脂比的影響

表2 各組小鼠肝指數(shù)、體脂比和血糖水平Table2 Liver index, fat to body mass ratio and blood glucose in each group

肝指數(shù)是動物的一項重要生理指標(biāo)。當(dāng)肝臟出現(xiàn)補(bǔ)償增生時，表明肝臟的解毒負(fù)擔(dān)也相應(yīng)增加[15]。由表2可知，KOS組小鼠的肝指數(shù)顯著低于MC組小鼠，且接近于NC組小鼠，說明魔芋低聚糖可以抑制高脂飲食小鼠肝臟的增大，有利于預(yù)防脂肪肝等疾病的發(fā)生。腎周脂肪和附睪脂肪，占動物機(jī)體脂肪總含量的一定比例，所以通常利用腎周脂肪和附睪脂肪占體質(zhì)量的百分比（體脂比）來反映小鼠的肥胖狀況。

實驗結(jié)束后，各組小鼠體脂比由高到低依次為：MC組、KOS組、NC組。MC組的小鼠體脂比顯著高于NC組小鼠（P＜0.05），這說明長期的高脂飲食會造成機(jī)體內(nèi)脂肪的過多累積。而低聚糖干預(yù)后，KOS組小鼠的體脂比顯著低于MC組，這說明低聚糖干預(yù)有效降低了小鼠體內(nèi)脂肪的積累。

在正常情況下，機(jī)體具有維持一定血糖水平的能力，以維持正常的糖脂代謝。高脂飼料會導(dǎo)致小鼠血糖水平升高，如果血糖水平持續(xù)升高會導(dǎo)致許多健康問題，比如糖尿病、心血管疾病等。在本實驗中，KOS組小鼠血糖水平低于MC組，但兩者并無顯著性差異。

2.3 膳食對小鼠血脂水平的影響

表3 各組小鼠血脂水平Table3 Blood lipid levels in each group mmol/L

由表3可知，與NC組相比，MC組小鼠TC、TG、LDL-C濃度顯著增加（P＜0.05），HDL-C濃度顯著降低，說明高脂飲食會導(dǎo)致小鼠脂代謝紊亂。與MC組相比，KOS組小鼠的TC、TG、LDL-C濃度顯著降低，HDL-C濃度顯著提高，說明低聚糖干預(yù)對高脂飲食的小鼠有降低高血脂癥的作用。

2.4 膳食對小鼠氧化應(yīng)激水平的影響

表1 各組小鼠氧化應(yīng)激水平Table1 Levels of oxidative stress in each group

如表4所示，與NC組相比，小鼠長期進(jìn)食高脂飼料導(dǎo)致高脂飲食小鼠T-SOD、GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA水平升高。對小鼠進(jìn)行低聚糖干預(yù)后，小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)有所改善。KOS組小鼠的T-AOC、T-SOD、GSH-Px水平與MC組相比顯著升高，MDA水平降低。這說明魔芋低聚糖干預(yù)對由高脂飲食引起的氧化應(yīng)激有抑制作用。

2.5 膳食對小鼠LDL-R、CPT、PPARα mRNA表達(dá)水平的影響

圖2 各組小鼠LDL-R（A）、CPT（B）、PPARα（C）mRNA的相對表達(dá)量Fig.2 mRNA expression levels of LDL-R （A）, CPT （B）, and PPARα （C）in liver

如圖2所示，與正常小鼠相比，高脂飲食會導(dǎo)致小鼠肝臟內(nèi)低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDL-R）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（carnitinepalmitoyltransferase 1a，CPT）、過氧化物酶增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）的mRNA表達(dá)顯著降低，而魔芋寡糖干預(yù)后小鼠肝臟內(nèi)LDL-R、CPT的mRNA表達(dá)上調(diào)，而PPARα的mRNA表達(dá)與MC組并無顯著性區(qū)別。

3 討 論

近年來，尋找安全高效的食品活性成分來代替藥物防治慢性代謝疾病成為科學(xué)研究的熱點[16]。低聚糖因其發(fā)熱值極低（很少能轉(zhuǎn)化為脂肪），可改善脂代謝，降低血脂和膽固醇[17]。在本實驗中，在高脂飲食飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的魔芋低聚糖，通過對小鼠的體質(zhì)量、肝指數(shù)、血脂及氧化應(yīng)激水平等指標(biāo)的測定，探索魔芋低聚糖對小鼠脂代謝及氧化應(yīng)激的影響。

實驗結(jié)果表明，高脂飲食可以使小鼠體質(zhì)量明顯上升，說明高脂飲食可以導(dǎo)致小鼠體內(nèi)脂肪的積累。與NC組相比，實驗結(jié)束后MC組小鼠體質(zhì)量明顯升高，低聚糖干預(yù)后小鼠體質(zhì)量顯著降低。說明低聚糖干預(yù)可以抑制高脂飲食小鼠體質(zhì)量的增加。高脂飲食會導(dǎo)致小鼠血液中的TC、TG水平異常升高，長期的高血脂水平會導(dǎo)致動脈粥樣硬化[18]。低聚糖干預(yù)后小鼠TC、TG、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著提高，說明低聚糖對高脂飲食的小鼠有降低高血脂癥的作用，這與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果[19]一致。

很多臨床與實驗研究已經(jīng)表明，在肥胖、血脂代謝紊亂狀態(tài)情況下，機(jī)體氧化應(yīng)激水平也會升高[20]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體促氧化物-抗氧化物之間動態(tài)平衡失調(diào)所導(dǎo)致的對細(xì)胞內(nèi)大分子的氧化損傷。高脂飲食可生成大量的活性氧，引起機(jī)體氧化應(yīng)激[21]。過量的活性氧會引起蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等生物大分子的氧化損傷，是高血脂、肥胖、糖尿病等營養(yǎng)性慢性代謝疾病發(fā)生、發(fā)展的根源[22-23]。已有研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可致組織中許多抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)酶表達(dá)減少、活性降低，導(dǎo)致機(jī)體清除氧自由基能力降低，從而對機(jī)體組織等造成損傷[24-25]。T-SOD對機(jī)體的抗氧-抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。GSH-Px特異性催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。MDA水平可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。高脂飲食會顯著降低小鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px（P＜0.05），提高M(jìn)DA水平（P＜0.05），造成機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高。與MC組相比，低聚糖干預(yù)后小鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px水平顯著提高，MDA水平降低，這說明魔芋低聚糖干預(yù)有助于抑制小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)。

為了進(jìn)一步研究KOS對脂質(zhì)代謝調(diào)控的分子機(jī)制，我們研究了脂代謝相關(guān)基因，檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因。CPT能與長鏈脂酰輔酶A合成脂酰肉堿，并將其轉(zhuǎn)運至線粒體而被氧化分解[26]。CPT是脂肪分解代謝相關(guān)基因，高脂飲食雖然會導(dǎo)致小鼠肝臟內(nèi)脂肪分解代謝相關(guān)基因CPT的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，表明高脂小鼠肝臟內(nèi)脂肪降解減慢，多余脂肪肝臟內(nèi)積累，但進(jìn)行KOS干預(yù)后小鼠CPT的mRNA顯著上調(diào)，表明低聚糖干預(yù)可以使小鼠肝臟內(nèi)脂肪降解加快，減少多余脂肪積累。LDL-R基因能夠移除血液LDL微粒中含有的膽固醇，對維持機(jī)體正常血液膽固醇水平具有重要作用[27]；LDL-R基因突變可以導(dǎo)致LDL-R功能異常和家族性高膽固醇血癥。上調(diào)LDL-R的表達(dá)可以降低血漿低密度脂蛋白膽固醇水平，降低心血管意外的發(fā)生率[28]。與NC組相比，KOS組小鼠LDL-R的mRNA顯著上調(diào)。PPARα可以通過激活脂肪氧化基因的表達(dá)促進(jìn)脂肪的降解，在脂類代謝中起著重要作用[29]。與正常小鼠相比，高脂飲食會導(dǎo)致小鼠肝臟內(nèi)PPARα的mRNA表達(dá)顯著降低，但進(jìn)行KOS干預(yù)后PPARα的mRNA表達(dá)與高脂組小鼠并無顯著區(qū)別。

綜上所述：在高脂飼料中直接添加魔芋低聚糖可以顯著降低小鼠的體質(zhì)量、肝指數(shù)、體脂比，改善血脂合成及氧化應(yīng)激水平：顯著增加T-AOC、T-SOD和GSH-Px水平，降低MDA水平。說明魔芋低聚糖對高脂飲食小鼠具有降低體質(zhì)量、肝指數(shù)、體脂比，改善血脂合成及抑制氧化應(yīng)激的功效；魔芋低聚糖干預(yù)后小鼠顯著上調(diào)CPT的mRNA表達(dá)，表明脂肪分解代謝加快，顯著上調(diào)LDL-R mRNA的表達(dá)可以降低血漿低密度脂蛋白膽固醇水平。