李鐵瑛，張纓

?

有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中補(bǔ)充Apelin對(duì)骨骼肌AMPK活化及線粒體能量代謝的影響

李鐵瑛，張纓

（北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)教研室，北京 100084）

目的：探討有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練補(bǔ)充apelin對(duì)骨骼肌AMPK活化及線粒體能量代謝的影響。方法：1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分采用小鼠骨骼肌C2C12細(xì)胞系作為研究對(duì)象，將靶向AMPKα基因的小干擾RNA（AMPKα siRNA）或陰性對(duì)照小干擾RNA（Control siRNA）通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行6 h的饑餓處理，而后在完全培養(yǎng)基中加入apelin-13（100 nmol/L）或者同體積的PBS與細(xì)胞孵育6 h。按轉(zhuǎn)染siRNA和加apelin-13情況，實(shí)驗(yàn)分為Control siRNA+PBS組、Control siRNA+apelin組、AMPK siRNA+PBS組與AMPK siRNA+apelin組。完成干預(yù)后，采用Seahorse細(xì)胞能量代謝分析系統(tǒng)，測(cè)定細(xì)胞線粒體基礎(chǔ)呼吸、ATP生成和呼吸功能變化。2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分采用C57BL/6J小鼠做為研究對(duì)象，將40只小鼠隨機(jī)分為安靜未注射組、安靜注射apelin組、運(yùn)動(dòng)未注射組和運(yùn)動(dòng)注射apelin組，每組10只。注射apelin組小鼠連續(xù)4周腹腔注射apelin-13（0.1 μmol /kg體重/天）。運(yùn)動(dòng)組采用75%左右最大攝氧量強(qiáng)度（1～2周坡度5o，速度15 m/min；3～4周坡度5o，速度20 m/min）、1 h/天、6天/周、持續(xù)4周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。最后一次運(yùn)動(dòng)后休息48 h，脫頸處死，取兩側(cè)股四頭肌。Western Blotting測(cè)定骨骼肌apelin、APJ、AMPKα、p-AMPKα(Thr172)和COX Ⅳ蛋白表達(dá)。結(jié)果：1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，Control siRNA+apelin組與Control siRNA+PBS組相比，細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸率、線粒體ATP生成和最大呼吸率均顯著增加；而AMPK siRNA+apelin組與Control siRNA+apelin組相比，線粒體ATP生成和最大呼吸率顯著降低。2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，安靜注射apelin組與安靜未注射組相比、運(yùn)動(dòng)注射apelin組與運(yùn)動(dòng)未注射組相比，小鼠骨骼肌apelin、APJ、COX Ⅳ蛋白表達(dá)和p-AMPKα/AMPKα比值均顯著增加。結(jié)論：外源性補(bǔ)充apelin可顯著增加C2C12細(xì)胞AMPK介導(dǎo)的線粒體呼吸功能，并提高有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠骨骼肌apelin/APJ、AMPKα磷酸化和COX IV蛋白表達(dá)，提示，有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練補(bǔ)充apelin可能對(duì)骨骼肌的apelin-AMPK通路及其介導(dǎo)的線粒體能量代謝有一定的積極促進(jìn)作用。

apelin；AMPK；有氧運(yùn)動(dòng)；線粒體；骨骼肌

骨骼肌作為機(jī)體最大的能量消耗器官，在運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要的能量代謝調(diào)節(jié)作用。Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體（O'Dowd et al.,1993;Katugampola et al.,2001），廣泛表達(dá)于人和鼠的脂肪、心臟和骨骼肌等組織器官中（Masri et al.,2005;De Falco et al.,2002），在調(diào)節(jié)心血管功能、胰島素分泌、食物和水?dāng)z取等方面具有多種生物學(xué)效應(yīng)（Gilbert,2017;Taheri,2002）。近年來apelin/APJ在機(jī)體（特別是骨骼肌）能量代謝調(diào)節(jié)中的作用引起了人們的關(guān)注（Indrakusuma et al.,2015;Bajer et al.,2015）。已有研究報(bào)道，急性或者慢性補(bǔ)充apelin可以促進(jìn)骨骼肌葡萄糖利用、脂肪酸氧化和線粒體生物合成（Isabelle et al.,2011）。并且一些學(xué)者認(rèn)為，apelin是細(xì)胞能量感受器——腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的上游調(diào)節(jié)者。通常磷酸化AMPKα（p-AMPKα(Thr172)）蛋白表達(dá)量表示AMPK激活程度或活性（Li et al.,2017）。Apelin可通過激活A(yù)MPK，增加p-AMPKα(Thr172)蛋白表達(dá)，提高骨骼肌的線粒體生物合成、糖吸收和脂肪酸氧化（Dray et al.,2008）。但也有報(bào)道認(rèn)為，外源性補(bǔ)充apelin促進(jìn)骨骼肌線粒體能量代謝物調(diào)節(jié)并非依賴于AMPK（Frier et al.,2009）R1765。

運(yùn)動(dòng)缺乏是導(dǎo)致肥胖、2型糖尿病和心血管疾病等的重要風(fēng)險(xiǎn)因素（Booth et al.,2012）。長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的健康效益至少部分取決于肌肉因子的產(chǎn)生（Son et al.,2018）。新近研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增加人體骨骼肌apelin mRNA的表達(dá)，apelin被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的肌肉因子（Besse et al., 2014）709-710。然而，在有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中補(bǔ)充apelin對(duì)骨骼肌apelin/AJP表達(dá)、AMPK活化和線粒體能量代謝的影響，以及AMPK在其中的調(diào)節(jié)作用，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究試圖首先采用C2C12骨骼肌成肌細(xì)胞系，通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染沉默細(xì)胞中的AMPKα，觀察給予apelin對(duì)細(xì)胞線粒體呼吸功能的影響；而后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，給予小鼠4周有氧訓(xùn)練并腹腔注射apelin，觀察骨骼肌中apelin、APJ、p-AMPKα和細(xì)胞色素C氧化酶亞基IV（COX IV）蛋白表達(dá)的變化。本研究將深入探討有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練介導(dǎo)apelin調(diào)控骨骼肌能量代謝及與AMPK的關(guān)系，為有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)健康的效應(yīng)機(jī)制提供進(jìn)一步理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.1.1 研究對(duì)象與方法

C2C12小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系，購自于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2 采用AMPKα siRNA轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞

使用含10% Gibco FBS（Thermo Fisher，USA）的DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone，USA），于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)C2C12細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度，PBS清洗3遍，加入0.25%胰蛋白酶消化液，待細(xì)胞消化完全，加入2mL新的10% FBS完全培養(yǎng)液制成懸濁液，終止消化。將細(xì)胞懸濁液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，1 000 rpm轉(zhuǎn)離心3 min。棄去上清，加入2 mL新的10% FBS完全培養(yǎng)液制成懸濁液，計(jì)數(shù)，將懸濁液稀釋成20×104個(gè)/mL的密度，按照每孔2.5 mL的量種板至6孔板中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%匯合時(shí)，按照LipofectamineTMRNAiMAX（Thermo Fisher，USA）操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞被分為Control siRNA和AMPKα siRNA組。6孔板每孔R(shí)NAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和Control siRNA（SC-37007, Satan Cruz）或AMPK siRNA（SC-45313，Satan Cruz）試劑用量比例為1:1:1，均為9 μL。

1.1.3 C2C12細(xì)胞線粒體呼吸功能測(cè)定

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，按上述步驟消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；計(jì)數(shù)，用新的完全培養(yǎng)基稀釋成密度為16×104個(gè)/mL（正常種板密度的80%）的細(xì)胞懸濁液。進(jìn)而，細(xì)胞種板到美國Seahorse XFe細(xì)胞能量代謝分析系統(tǒng)（Seahorse Bioscience，USA）配套特制的96孔板中，室溫放置1 h后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，將培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基換成DMEM，進(jìn)行6 h細(xì)胞饑餓處理。之后，將Control siRNA和 AMPK siRNA組細(xì)胞進(jìn)一步分為加入PBS和apelin-13（Sigma，USA）組。PBS和apelin-13組每孔內(nèi)分別加入20 ul PBS和20 ul apelin-13溶液（濃度為100 nmol/L），孵育6 h。6 h后取出96孔板，按照Seahorse說明書步驟操作，測(cè)定C2C12細(xì)胞線粒體呼吸功能。其中采用的藥品濃度分別為：寡霉素（Oligomycin，2μmol/L）、三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（FCCP，1μmol/L）、抗霉素（Antimycin，1μmol/L) 和魚藤酮（Rotenone，1μmol/L）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 對(duì)象與分組

健康8周齡的C57BL/6J小鼠40只[購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證:SCXK(京)2015-0001]，體重18±2 g。將小鼠隨機(jī)分為安靜組和運(yùn)動(dòng)組，進(jìn)一步再分別分為未注射apelin組（No apelin，N）和apelin-13（Sigma，USA）apelin注射組（Apelin，A），每組10只。

Apelin注射組采用腹腔注射方式給予apelin，注射劑量為0.1μmol/kg體重/天。注射時(shí)間為每天11:00，持續(xù)28天。運(yùn)動(dòng)組采用75%左右最大攝氧量強(qiáng)度（1～2周坡度5o，速度15 m/min；3～4周坡度5o，速度20 m/min），1 h/天，6天/周，持續(xù)4周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。安靜組不施加任何運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，正常飼養(yǎng)。

小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只，室內(nèi)溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，光照12 h/天（7:00～19:00），采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。最后一次運(yùn)動(dòng)后休息48 h，脫頸處死。取兩側(cè)股四頭肌，迅速稱量，錫紙包裹，標(biāo)記編號(hào)，立刻投入液氮。取材完成后，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，保存待用。

1.2.2 Western blotting測(cè)定蛋白表達(dá)

取50 mg骨骼肌加入500 μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Thermo Fisher，USA）的RIPA裂解液（碧云天，中國）中。使用勻漿機(jī)充分勻漿，于冰上靜置30 min，其間每隔10 min渦旋振蕩10 s；4℃、12 000 rpm離心30 min；取樣品上清即為總蛋白，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

采用BCA蛋白濃度試劑盒（Thermo Fisher，USA）測(cè)定骨骼肌的總蛋白濃度。按照每個(gè)樣品上樣蛋白總量20 μg，計(jì)算上樣體積。采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝膠（Life technologies，USA），電泳分離目的蛋白及內(nèi)參。而后，采用轉(zhuǎn)膜膠（iBlot?2 NC Regular Stacks，USA）于iBlot Gel Transfer System（Life technologies，USA）轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂牛奶封閉1 h，加一抗于層析柜中孵育過夜。一抗稀釋比例依次為apelin（1:1 000，Satan Cruz，SC-33823），APJ（1:1 000，Satan Cruz，SC-29341），AMPKα（1:500，Satan Cruz，SC-74461），p-AMPKα(Thr172)（1:1 000，Satan Cruz，SC-33524），COX Ⅳ（1:2 000，Abbkine，A01060），內(nèi)參β-actin（1:1 000，Santa Cruz，SC-47778）。次日，1×TBST洗膜3次，每次10 min。之后加1×TBST稀釋的二抗，二抗稀釋比例：羊抗兔（1:40 000，Thermo Fisher，31460）、羊抗小鼠（1:40 000，Thermo Fisher，31430）。室溫?fù)u床搖晃孵育1 h。1×TBST洗膜3次，每次10 min。條帶加ECL western blot substrate（Life technologies，USA）發(fā)光液，放入曝光機(jī)（Bio-Rad ChemiDocTMXRS+，USA）曝光。用儀器自帶分析軟件，讀取條帶相對(duì)灰度值，計(jì)算結(jié)果。其結(jié)果計(jì)算公式如下：

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用雙因素方差分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±表示。＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義，＜0.05表示有顯著性；＜0.01表示有非常顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

圖1 各組細(xì)胞線粒體呼吸功能

Figure 1. Mitochondrial Oxygen Consumption Rate

注：*和**分別表示與相應(yīng)未注射組相比P＜0.05和P＜0.01；下同。

Figure 2. Apelin Protein Expression in Skeletal Muscle of Mice

圖3 各組小鼠骨骼肌APJ蛋白相對(duì)表達(dá)量

Figure 3. APJ Protein Expression in Skeletal Muscle of Mice

圖1A是Seahorse測(cè)定線粒體氧化速率過程示意圖。由圖1B可知，Control siRNA+apelin組與Control siRNA+PBS組相比，線粒體基礎(chǔ)呼吸率顯著增加；AMPK siRNA+apelin組與AMPK siRNA+PBS組相比，基礎(chǔ)呼吸率顯著增加。由圖1C、D可知，Control siRNA+apelin組與Control siRNA+PBS組相比，線粒體ATP生成和最大呼吸率均顯著增加；且AMPK siRNA+apelin組與Control siRNA+apelin組相比，線粒體ATP生成和最大呼吸率均顯著降低。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 骨骼肌apelin蛋白相對(duì)表達(dá)

由圖2可知，安靜注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌apelin蛋白表達(dá)顯著增加；運(yùn)動(dòng)注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌apelin蛋白表達(dá)也顯著增加。

2.2.2 骨骼肌APJ蛋白相對(duì)表達(dá)

由圖3可知，安靜注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌APJ蛋白表達(dá)顯著增加；運(yùn)動(dòng)注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌APJ蛋白表達(dá)顯著增加。

2.2.3 骨骼肌AMPKα、p-AMPKα蛋白相對(duì)表達(dá)及其比值

圖4 各組小鼠骨骼肌AMPKα、p-AMPKα蛋白相對(duì)表達(dá)量及其比值

Figure 4. AMPKα、p-AMPKα Protein Expression and their Ratio in Skeletal Muscle of Mice

由圖4C可知，安靜注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌p-AMPKα/AMPKα比值顯著增加；運(yùn)動(dòng)注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌p-AMPKα/AMPKα比值顯著增加。

2.2.4 骨骼肌 COX Ⅳ蛋白相對(duì)表達(dá)

圖5 各組小鼠骨骼肌COXⅣ蛋白相對(duì)表達(dá)量

Figure 5. COX Ⅳ Protein Expression in Skeletal Muscle of Mice

由圖5可知，運(yùn)動(dòng)注射apelin組與其未注射組相比，小鼠骨骼肌COX Ⅳ蛋白表達(dá)顯著增加。

3 分析討論

3.1 AMPK在apelin調(diào)節(jié)C2C12細(xì)胞線粒體呼吸功能中的作用

Apelin能夠調(diào)節(jié)骨骼肌中的線粒體氧化能力及其生物合成。實(shí)驗(yàn)表明，apelin 能夠增強(qiáng)線粒體能量代謝。高脂飲食小鼠連續(xù)腹腔注射apelin-13（0.1 μmol/kg體重/天）28天后，離體測(cè)定小鼠離體的比目魚肌氧耗量。結(jié)果表明，apelin注射組的氧耗量顯著高于PBS組（Attane et al.,2012）。1 μmol/L的apelin孵育24 h后，脂肪細(xì)胞中的PGC-1α、COX I和SDHA等線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加（Than et al.,2014）。采用普通大鼠連續(xù)2周腹腔注射apelin-13，其股三頭肌中的檸檬酸合酶、COX IV和β-羥酯酰輔酶A脫氫酶（β-HAD）的活性顯著增加，并且核編碼線粒體蛋白基因和線粒體編碼的COX IV和COX I表達(dá)也顯著增加（Frier et al.,2009）R1764。高脂飼養(yǎng)apelin 轉(zhuǎn)基因（TG）和野生（WT）鼠20周后，TG鼠比WT鼠的骨骼肌線粒體數(shù)量顯著增加，且肌纖維中I型（氧化型）肌纖維比例顯著提高（Yamamoto et al.,2011）860-861。

AMPK是機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)中心，而線粒體是細(xì)胞的能量工廠。研究表明，AMPK可以通過調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和提高線粒體內(nèi)的酶活性等途徑增強(qiáng)線粒體能量代謝（Abbott et al.,2014; Marcinko et al.,2014; Wu et al.,1999）。關(guān)于apelin調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝是否通過AMPK作用，目前仍有爭(zhēng)議（Frier et al.,2009R1765; Bertrand et al.,2015）。本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMPK siRNA+apelin與Control siRNA+apelin組相比，ATP轉(zhuǎn)換率和最大呼吸能均顯著降低。表明AMPK沉默顯著可降低apelin補(bǔ)充介導(dǎo)的C2C12細(xì)胞線粒體呼吸功能，AMPK可直接參與apelin對(duì)C2C12細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)。另外，AMPK siRNA+PBS組與Control siRNA+PBS組相比，線粒體呼吸功能無顯著性變化。這一結(jié)果與他人的一些研究相一致（Wang et al.,2014; Fentz et al.,2015）。一篇采用脂肪細(xì)胞的研究，通過AMPKα siRNA敲低脂肪細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，其線粒體呼吸功能與正常脂肪細(xì)胞無差異（Wang et al.,2014）。另一篇對(duì)AMPK敲除小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，AMPK敲除鼠每日耗氧量和呼吸交換率與野生鼠相比也無顯著性差異（Fentz et al.,2015）。以上結(jié)果均表明，無外源性補(bǔ)充apelin的狀態(tài)下，沉默AMPKα對(duì)線粒體呼吸功能影響不大。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練補(bǔ)充apelin對(duì)骨骼肌apelin、AMPKα磷酸化和COX IV表達(dá)的影響

3.2.1 有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和apelin補(bǔ)充對(duì)骨骼肌apelin/APJ的影響

APJ作為apelin的受體，其在組織中的表達(dá)變化與apelin基本一致。文獻(xiàn)已表明，apelin轉(zhuǎn)基因小鼠、補(bǔ)充apelin或敲除apelin基因，其骨骼肌（Yamamoto et al.,2011）859、血管內(nèi)皮（Strohbach et al.,2018）、心肌細(xì)胞（Bi et al.,2018）、黃體細(xì)胞（Ró?ycka et al.,2018）、脂肪細(xì)胞（Than et al.,2014）等組織中，APJ蛋白表達(dá)量隨apelin表達(dá)量增減而變化。盡管新近研究表明，運(yùn)動(dòng)可引起apelin mRNA表達(dá)增加，被認(rèn)為是新發(fā)現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)引起的肌肉因子（Besse et al.,2014709-712; Yang et al.,2015），但目前的研究結(jié)果并不完全相同。例如，有研究報(bào)道，Zuker大鼠進(jìn)行6周跑臺(tái)耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，比目魚肌中的apelin蛋白表達(dá)顯著性降低，而趾長(zhǎng)伸肌中apelin蛋白表達(dá)未發(fā)生變化（Son et al.,2017）。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，無論注射apelin還是未注射apelin，4周有氧訓(xùn)練小鼠股四頭肌中apelin和APJ的蛋白表達(dá)并未發(fā)生顯著變化。推測(cè)這是否與4周有氧運(yùn)動(dòng)的時(shí)間不足或取材的肌纖維類型不同時(shí)間點(diǎn)有關(guān)，但仍有待進(jìn)一步確定。

進(jìn)而，無論是安靜還是運(yùn)動(dòng)組，補(bǔ)充apelin均可促進(jìn)骨骼肌apelin和APJ的蛋白表達(dá)。說明在本實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充apelin（0.1 μmol/kg體重/天，28天）比運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨骼肌apelin/ AJP蛋白表達(dá)的作用更強(qiáng)。

3.2.2 有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練補(bǔ)充apelin對(duì)骨骼肌AMPKα磷酸化和COX IV表達(dá)的影響

已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，外源性補(bǔ)充apelin可增加骨骼肌AMPKα磷酸化蛋白表達(dá)（Yue et al.,2010; Vinel et al.,2018）。在本實(shí)驗(yàn)中的研究結(jié)果與其一致，并且在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中補(bǔ)充apelin同樣可促進(jìn)AMPKα活化。COX IV是線粒體中電子傳遞鏈的末端酶，催化電子從細(xì)胞色素C轉(zhuǎn)移到氧，對(duì)線粒體能量代謝至關(guān)重要（Oliva et al.,2015）。AMPK可調(diào)節(jié)COXIV的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體的呼吸功能（Ritchie et al.,2014）。本研究中有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練補(bǔ)充apelin，可進(jìn)一步增加骨骼肌COX IV蛋白表達(dá)，表明有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練補(bǔ)充apelin可能通過骨骼肌apelin/APJ-AMPK活化-COX IV蛋白表達(dá)這一信號(hào)通路，對(duì)線粒體進(jìn)行調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

外源性補(bǔ)充apelin可顯著增加C2C12細(xì)胞AMPK介導(dǎo)的線粒體呼吸功能，并提高有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠骨骼肌apelin/ APJ、AMPKα磷酸化和COX IV蛋白表達(dá)。提示，有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練補(bǔ)充apelin可能對(duì)骨骼肌的apelin-AMPK通路及其介導(dǎo)的線粒體能量代謝有一定的積極促進(jìn)作用。

ABBOTT M J, TURCOTTE L P,2014. AMPK-a2 is involved in exercise training-induced adaptations in insulin-stimulated metabolism in skeletal muscle following high-fat diet[J]. J Appl Physiol,117(8):869-879.

ATTANE C, FOUSSAL C, LE GONIDEC S, et al., 2012.Apelin treatment increases complete Fatty Acid oxidation, mitochondrial oxidative capacity, and biogenesis in muscle of insulin-resistant mice [J]. Diabetes, 61(2): 310-320.

BAJER B, VLCEK M, GALUSOVA A, et al., 2015. Exercise associated hormonal signals as powerful determinants of an effective fat mass loss[J]. Endocr Regul, 49(3):151-163.

BESSE P A, MONTASTIER E, Vinel C, et al., 2014. Effect of endurance training on skeletal muscle myokine expression in obese men: identification of apelin as a novel myokine [J]. Int J Obes, 38(5): 707-713.

BERTRAND C, VALET P, CASTANLAURELL I, 2015. Apelin and energy metabolism[J]. Front Physiol, 6: 115.

BI F, XU Y, SUN Q, 2018.Catalpol pretreatment attenuates cardiac dysfunction following myocardial infarction in rats [J]. Anatol J Cardiol, 19(5):296-302.

BOOTH F W, ROBERTS C K, LAYE M J,2012. Lack of exercise is a major cause of chronic diseases[J]. Compr Physiol, 2(2):1143-1211.

FALCO M D, LUCA L D, ONORI N, et al., 2002. Apelin expression in normal human tissues [J]. In vivo, 16(5): 333-336.

DRAY C, KNAUF C, DAVIAUD D, et al., 2008. Apelin stimulates glucose utilization in normal and obese insulin-resistant mice [J]. Cell Metab, 8(5): 437-45.

FENTZ J, KJφBSTED R, KRISTENSEN C M, et al., 2015.AMPKα is essential for acute exercise-induced gene responses but not for exercise training-induced adaptations in mouse skeletal muscle[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 309 (11):E900-914.

FRIER B C, WILLIAMS D B, WRIGHT D C, 2009. The effects of apelin treatment on skeletal muscle mitochondrial content[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 171(297):R1761-1768.

GILBERT J S,2017. From apelin to exercise: emerging therapies for management of hypertension in pregnancy [J]. Hypertens Res, 40(6):519-525.

INDRAKUSUMA I, SELL H, ECKEL J, 2015. Novel Mediators of Adipose Tissue and Muscle Crosstalk[J]. Curr Obes Rep, 4(4):411-417.

ISABELLE C L, CAMILLE A, THIBAUT D, et al., 2011. Apelin, diabetes, and obesity[J]. Endocrine, 40(1):1-9.

KATUGAMPOLA S D, MAGUIRE J J, MATTHEWSON S R, et al., 2001. [(125)I]-(Pyr(1))Apelin-13 is a novel radioligand for localizing the APJ orphan receptor in human and rat tissues with evidence for a vasoconstrictor role in man [J]. British journal of pharmacology, 132(6): 1255-60.

LI J, LI S, WANG F, et al., 2017. Structural and biochemical insights into the allosteric activation mechanism of AMP-activated protein kinase[J]. Chem Biol Drug Des, 89(5): 663-669.

MARCINKOarcinko K, STEINBERG G R, 2014. The role of AMPK in controlling metabolism and mitochondrial biogenesis during exercise[J]. Exp Physiol, 99(12):1581-1585.

MASRI B, KNIBIEHLER B, AUDIGIER Y,2005. Apelin signalling: a promising pathway from cloning to pharmacology [J]. Cellular signalling, 17(4): 415-426.

O'DOWD B F, HEIBEReiber M, Chan A, et al., 1993. A human gene that shows identity with the gene encoding the angiotensin receptor is located on chromosome 11 [J]. Gene, 136(1-2):355-360.

OLIVA C R，MARKERT T，GILLESPIE G Y，et al., 2015. Nuclear-encoded cytochrome c oxidase subunit 4 regulates BMI1 expression anddetermines proliferative capacity of high-grade gliomas [J]. Oncotarget, 6(6): 4330- 4344.

RITCHIE I R, MACDONALDT L, WRIGHT D C, et al., 2014. Adiponectin is sufficient, but not required, for exercise-induced increases in the expression of skeletal muscle mitochondrial enzymes[J]. J Physiol, 592(12): 2653-2665.

ROZYCKA M, KUROWSKA P, GRZESIAK M, et al., 2018. Apelin and apelin receptor at different stages of corpus luteum development and effect of apelin on progesterone secretion and 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) in pigs [J]. Anim Reprod Sci, 192: 251-260.

SON J S, KIM H J, SON Y, et al., 2017. Effects of exercise-induced apelin levels on skeletal muscle and their capillarization in type 2 diabetic rats [J]. Muscle Nerve,56(6):1155-1163.

SON J S, SONG A C, TESTROET E D, et al., 2018. Exercise-induced myokines: a brief review of controversial issues of this decade[J]. Expert Rev Endocrinol Metab, 13(1):51-58.

STROHBACH A, PENNEWITZ M, GLAUBITZ M, et al., 2018. The apelin receptor influences biomechanical and morphological properties of endothelial cells[J]. J Cell Physiol, 233(8):6250-6261.

TAHERI S, MURPHY K, COHEN M, et al., 2002.The effects of centrally administered apelin-13 on food intake, water intake and pituitary hormone release in rats [J]. Biochem Biophys Res Commun, 291(5): 1208-1212.

THAN A, ZHANG X, LEOW M K, et al., 2014.Apelin attenuates oxidative stress in human adipocytes.[J]. J Biol Chem, 289(6): 3763-3774.

WANG L, DI L, NOGUCHI CT, 2014. AMPK is Involved in Mediation of Erythropoietin Influence on Metabolic Activity and Reactive Oxygen Species Production in White Adipocytes[J]. Int J Biochem Cell Biol, 54(8):1-9.

WU Z, PUIGSERVER P, ANDERSSON U, et al., 1999. Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC-1[J]. Cell, 98(1):115-124.

YAMAMOTO T, HABATA Y, MATSUMOTO Y, et al., 2011. Apelin-transgenic mice exhibit a resistance against diet-induced obesity by increasing vascular mass and mitochondrial biogenesis in skeletal muscle [J]. Biochim Biophys Acta, 1810(9): 853-862.

YANG H, ZHAO L, ZHANG J, et al.,2015.Effect of Treadmill Running on Apelin and APJ Expression in Adipose Tissue and Skeletal Muscle in Rats Fed a High-fat Diet [J]. Int J Sports Med, 36(7): 535-541.

YUE P, JIN H, AILLAUD M, et al., 2010.Apelin is necessary for the maintenance of insulin sensitivity [J]. Am J Physiol-Endoc M, 298(1): E59-67.

VINEL C, LUKJANENKO L, BATUT A, et al., 2018. The exerkine apelin reverses age-associated sarcopenia[J]. Nat Med, 24(9):1360-1371.

Effects of Apelin Supplement during Aerobic Training on AMPK Activation and Mitochondrial Energy Metabolism in Skeletal Muscle

LI Tieying, ZHANG Ying

Objective:To investigate the effects of apelin supplement during aerobic training on AMPK activation and mitochondrial energy metabolism in skeletal muscle. Methods: In the cell experiments, the AMPKα specific small interfering RNA（AMPKα siRNA）or a negative control interfering RNA（Control siRNA） were transfected into mice skeletal muscle C2C12 cells by Lipofectamine. Starvation treatment was performed for 6 hours after 48 hours transfection, and then cells were incubated with apelin-13 or PBS for 6 hours in complete medium to observe the changes in mitochondrial basal respiration, ATP production, and respiratory function. In the animal experiments, forty 8-week-old C57BL/6J mice were randomly divided into four groups (n=10 in each group): sedentary without apelin treatment, sedentary with apelin treatment, exercise training without apelin treatment and exercise training with apelin treatment group. The apelin treatment groups were injected intraperitoneally with apelin-13 at 0.1 μmol/kg/day for 4 weeks. The exercise groups were trained 6 days/week, 1 hour/day for 4 weeks by running on a treadmill at 75% VO2max. 48 hours after the last session of exercise training, the quadriceps were collected. The protein expressions of apelin, APJ, AMPKα, p-AMPKα (Thr172) and COX IV in skeletal muscles was measured by Western Blotting. Results: 1) In the cell experiments, the basal respiration rate, mitochondrial ATP production and maximum respiration rate were significantly increased in the Control siRNA+apelin group compared with the Control siRNA+PBS group, but the mitochondrial ATP production and maximum respiration rate were significantly decreased in the AMPK siRNA+apelin group compared with the Control siRNA+apelin group. 2) In the animal experiments, the protein expression of apelin, APJ, COX IV and the p-AMPKα/AMPKα ratio in skeletal muscles were significantly increased in the apelin treatment groups compared with no apelin treatment groups. Conclusion: The exogenous supplementation of apelin was significantly increased the AMPK-mediated mitochondrial respiratory function in C2C12 cells, and the apelin supplement during aerobic training was also significantly increased the apelin/APJ, COX IV protein expression and the p-AMPKα/AMPK ratio in skeletal muscles. The results suggested that the combination of aerobic exercise training with apelin supplement might activates the apelin-AMPK pathway and improves the mitochondrial energy metabolism in skeletal muscles.

1000-677X(2019)01-0055-06

10.16469/j.css.201901008

2018-11-09；

2018-12-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31640044);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助課題(2018XS001)

李鐵瑛(1988-),女,在讀博士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與骨骼肌健康的代謝適應(yīng),E-mail:yingyingziying@ 163.com。

張纓(1961-),女,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向運(yùn)動(dòng)與骨骼肌健康的代謝適應(yīng),E-mail: zhyi9256 @126.com。

G804.7

A