顱骨組織工程復(fù)合支架動態(tài)灌注裝置的設(shè)計

李?佳，張崇越，鄭淑賢，亓?劍，付志明

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顱骨組織工程復(fù)合支架動態(tài)灌注裝置的設(shè)計

李?佳，張崇越，鄭淑賢，亓?劍，付志明

(天津大學(xué)裝備設(shè)計與制造技術(shù)天津市重點實驗室，天津 300350)

為了解決顱骨組織工程支架中存在的中心處細胞存活率低的問題，針對具有血管嵌入的顱骨復(fù)合支架研制動態(tài)灌注培養(yǎng)裝置，為多孔支架內(nèi)部細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)以提高細胞存活率，使復(fù)合支架達到體內(nèi)整合的要求．基于顱骨復(fù)合支架結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計雙通道循環(huán)分別對多孔支架和血管進行灌注，為顱骨復(fù)合支架中成骨細胞和內(nèi)皮細胞提供物質(zhì)傳輸，氣體循環(huán)為循環(huán)培養(yǎng)液提供氧氣、二氧化碳，保證了培養(yǎng)液氧氣充足和pH穩(wěn)定；模擬人體自然顱骨組織中機械刺激，建立多孔支架、血管流體模型，根據(jù)灌注室和血管入口流量計算流體所需的剪切應(yīng)力，據(jù)此確定流體流量和壓力的控制范圍與精度，為復(fù)合支架提供合適的流量；設(shè)計三因素三水平正交試驗對灌注室的結(jié)構(gòu)尺寸進行優(yōu)選，確定關(guān)鍵部位灌注室的結(jié)構(gòu)，通過硅膠管連接灌注室、儲液瓶、蠕動泵形成循環(huán)系統(tǒng)，實現(xiàn)動態(tài)灌注裝置的總體結(jié)構(gòu)安裝；建立流體仿真分析有限元模型，分析不同流速的流體培養(yǎng)液分別對顱骨多孔支架和血管結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明灌注室和血管結(jié)構(gòu)內(nèi)流體速度、剪切應(yīng)力、壓力分布均勻，滿足骨組織和內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)生理環(huán)境，驗證了裝置設(shè)計的合理性．該裝置可用于骨組織體外細胞的動態(tài)培養(yǎng)，為骨組織工程支架體外構(gòu)建及血管化奠定了基礎(chǔ)．

顱骨；組織工程；復(fù)合支架；動態(tài)灌注；流體模型

在骨組織工程中，支架作為載體，其外形可以提供形態(tài)支撐，內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)可為細胞的貼附以及營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸提供保障，從而維持或改善組織功能和結(jié)構(gòu)[1-2]．目前，體外支架與細胞的整合通常采用靜態(tài)方式進行，但存在營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足、代謝廢物無法排除導(dǎo)致細胞壞死、無法在支架中心形成細胞基質(zhì)等問題[3-4]．動態(tài)培養(yǎng)可解決上述問題，它通過動態(tài)灌注方式，使培養(yǎng)液持續(xù)流動，加快營養(yǎng)物質(zhì)的輸送和交換，有利于支架中心的細胞生長[5]．此外，動態(tài)灌注所產(chǎn)生的流體剪切應(yīng)力加強細胞信號通道的活躍，促進堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、collagen I、骨橋蛋白等特殊基因表達，可提高細胞的增殖和分化[6-9]．在血管支架的動態(tài)培養(yǎng)中，流體剪切應(yīng)力可促進內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的表達[10]．

近年來，各式動態(tài)灌注設(shè)備已經(jīng)被應(yīng)用到骨組織工程修復(fù)當(dāng)中．Santoro等[11]和Bhaskar等[12]為培養(yǎng)大面積骨組織，采用了多出入口的方式進行動態(tài)灌注，促進了細胞在3D支架中的增殖與分化．Jagodzinski等[13]采用周期性壓力培養(yǎng)多孔支架中的骨細胞，并分析了周期性機械刺激對成骨細胞增殖與分化的影響．但是，在動態(tài)灌注培養(yǎng)支架-細胞的體外整合研究中，仍發(fā)現(xiàn)其骨細胞的存活率低，成骨緩慢．研究表明由于支架中沒有血管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞營養(yǎng)物質(zhì)的供給受到限制，骨細胞不能深入支架內(nèi)部，造成成骨能力下降[14-15]．

針對這一問題，筆者基于前期顱骨板障及其內(nèi)部靜脈的仿生研究[16]，設(shè)計了具有血管嵌入式的顱骨復(fù)合支架，其三維結(jié)構(gòu)如圖1所示．在此，提出了一種顱骨血管復(fù)合支架的動態(tài)灌注方法，研制新型的動態(tài)灌注裝置以解決常規(guī)靜/動態(tài)培養(yǎng)中出現(xiàn)的骨細胞存活率低、成骨緩慢等問題，并通過流體仿真分析，驗證裝置設(shè)計的可行性，為骨組織工程體外血管化的實現(xiàn)提供技術(shù)基礎(chǔ)．

圖1?顱骨復(fù)合支架結(jié)構(gòu)示意

1?動態(tài)灌注裝置設(shè)計

為模擬自然顱骨組織的物質(zhì)交換過程，在此提出雙通道動態(tài)灌注方式，即分別對顱骨多孔支架通道和血管結(jié)構(gòu)通道獨立進行灌注．以下主要從循環(huán)系統(tǒng)、灌注室流體模型、仿真分析等3個方面闡述該動態(tài)灌注系統(tǒng)的研制過程．

1.1?循環(huán)系統(tǒng)的設(shè)計

雙通道灌注循環(huán)系統(tǒng)如圖2所示，多孔支架灌注通道為黃色線，代表支架培養(yǎng)液，采用硅膠管通過接口C、D連接灌注室，與灌注室形成灌注循環(huán)回路；血管灌注通道為紅色線，代表血管培養(yǎng)液，硅膠管通過接口A、B與血管結(jié)構(gòu)出入口連接，與血管形成灌注循環(huán)回路．循環(huán)系統(tǒng)分為氣體循環(huán)和液體循環(huán)，氣體循環(huán)是棕色線，為動態(tài)培養(yǎng)提供二氧化碳、氧氣，維持培養(yǎng)液的pH值和氧氣濃度的穩(wěn)定；液體循環(huán)為細胞提供營養(yǎng)液、排除代謝廢物，并產(chǎn)生一定的剪切應(yīng)力、壓應(yīng)力，刺激細胞的生長．整個循環(huán)過程中，由蠕動泵提供動力，輸送培養(yǎng)液和混合氣體，實現(xiàn)灌注循環(huán)．

圖2?灌注循環(huán)系統(tǒng)示意

1.2?灌注流體模型的建立

1.2.1?支架剪切應(yīng)力的計算

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

因此，細胞在多孔支架孔隙中受到的剪切應(yīng)力可以通過Darcy速度公式進行計算，多孔支架空隙剪切應(yīng)力為

(6)

得

(7)

由此得到多孔支架的剪切應(yīng)力計算公式，為后面多孔支架通道流量提供依據(jù)．

1.2.2?血管剪切應(yīng)力的計算

(8)

(9)

靜脈血管血流量、脈動小，所以可以近似認為滿足Poiseuille流動[19]．

體積流量

(10)

血管壁剪切應(yīng)力

(11)

血管最大流速

(12)

血管平均流速

(13)

綜上可知

(14)

通過建立灌注流體模型，得到了血管剪切應(yīng)力計算公式，為第2.1節(jié)血管流量計算提供依據(jù)．

1.3?灌注室的設(shè)計

復(fù)合支架放置在灌注室中進行灌注，灌注室的結(jié)構(gòu)尤為重要，因此，需要對灌注室結(jié)構(gòu)進行詳細設(shè)計．針對血管嵌入的復(fù)合支架的特殊結(jié)構(gòu)及其雙通道灌注方式，設(shè)計了如圖3(a)所示的灌注室．灌注分為Ⅰ和Ⅱ兩個對稱的腔室，采用圓柱和半球組合的結(jié)構(gòu)，以使流體流速分布更加均勻．

圖3?灌注室結(jié)構(gòu)與尺寸示意

表1?因素水平表

Tab.1?Factor and level table

表2?正交試驗結(jié)果

Tab.2?Orthogonal experimental results

表3?極差法分析結(jié)果

Tab.3?Analysis results of step method

將灌注室設(shè)計為Ⅰ和Ⅱ兩部分，如圖4所示，并設(shè)計凹槽安放顱骨復(fù)合支架．灌注室Ⅰ和Ⅱ部分用螺栓固定法蘭盤形成密閉的灌注室，作為培養(yǎng)液灌流、儲存的結(jié)構(gòu)．

圖4?灌注室模型

2?灌注系統(tǒng)流量計算與裝置加工

2.1?流體流量計算

在動態(tài)灌注裝置中，流量是系統(tǒng)最重要的輸入量，不僅為細胞提供合適范圍的營養(yǎng)物質(zhì)，也為細胞提供剪切應(yīng)力促進細胞的增殖，因此流量的計算非常必要．下面分別計算支架和血管入口的流量．

對于血管流量，參考直徑約為2mm的下矢狀竇靜脈流速和壓力[25]類比人體顱骨板障靜脈，得到血管平均流速為0.10m/s，出口平均壓力為1.5kPa，周期為0.4～1.0s，平均流量為0.08mL/s．因此，根據(jù)式(8)和(9)，得到血流流量和壓力分別為

表4?顱骨多孔支架參數(shù)

Tab.4?Parameters of porous scaffold for skull

(15)

(16)

圖5?血管壓力和流量曲線

(17)

控制柜中PLC控制頻率隨時間變化，得到恒定或者脈動轉(zhuǎn)速，可實現(xiàn)恒定或脈動流量灌注支架．

2.2?灌注裝置加工

根據(jù)上述設(shè)計結(jié)果采用無毒的有機玻璃制造灌注室，在灌注室Ⅰ和Ⅱ之間采用O型密封圈密封，通過6個螺栓連接法蘭盤形成灌注室，如圖6(a)所示．動態(tài)灌注裝置實物如圖6(b)所示，整個灌注裝置主要由控制柜和灌注循環(huán)柜組成．該裝置的特性在于可同時對多孔支架和血管實現(xiàn)動態(tài)灌注；還可對多灌注室同時灌注，方便進行對比試驗．

圖6?灌注室和動態(tài)灌注裝置實物圖

3?仿真分析

利用ANSYS Workbench建立流體力學(xué)有限元模型，分析灌注流量對于復(fù)合支架及血管的影響，確定最優(yōu)流量，得到恰當(dāng)?shù)膽?yīng)力分布，驗證裝置的可行性．課題組前期采用具有較好生物相容性的羥基磷灰石作為支架材料，驗證了該材料的可行性[27]，并且分析得到復(fù)合支架的變形量相對較小，所以本文不考慮支架變形對流體應(yīng)力的影響，而主要分析流體對支架及血管應(yīng)力影響，為后續(xù)流量設(shè)定提供指導(dǎo)作用．

3.1?灌注室-支架仿真分析

3.1.1?灌注室-支架流體模型

(1) 幾何模型．建立支架灌注室模型，導(dǎo)入到Workbench中．

(3) 網(wǎng)格劃分．對流體采用四面體網(wǎng)格劃分，在支架孔隙處加密網(wǎng)格．

(5) 流體模型與求解器．在光滑圓管中，雷諾數(shù)決定了層流過渡為湍流的條件，即

(18)

3.1.2?結(jié)果與討論

圖7?不同入口速度對支架應(yīng)力影響

圖8?顱骨多孔支架應(yīng)力分布

(2) 支架剪切應(yīng)力分布基本均勻，均值為0.36Pa，最大值在入口側(cè)中心處為1.431Pa，從支架中心到邊緣，速度明顯減小，由式(6)可知，剪切應(yīng)力逐漸減小．滿足成骨細胞剪切應(yīng)力生長的需求，即0.30～2.86Pa[22-24]．

(3) 培養(yǎng)液對支架的壓力分布均勻，均值為700Pa，最大值在入口處為705Pa，適合骨細胞生長的范圍0～20kPa[28]．壓力從入口方向向出口方向逐漸減小，產(chǎn)生壓力梯度，是培養(yǎng)液流動的動力．另外，壓力在支架中心處局部增大，原因是培養(yǎng)液對中心處的支架產(chǎn)生一定的沖擊，使得局部壓力增大．

3.2?血管仿真分析

3.2.1?血管流體模型

在光滑圓管中，雷諾數(shù)決定了層流過渡為湍流的條件，即

(20)

3.2.2?結(jié)果與討論

(1) 血管中流體流速分布均勻且大部分位置流速在0.10m/s左右，同時中間主血管的流速大于周圍血管，符合人體血管流速特征[25]．

(2) 血管內(nèi)剪切應(yīng)力分布均勻，均值為1.7Pa，入口處最大為11.9Pa，滿足內(nèi)皮細胞生長的需求[26]．

圖9?不同入口速度對血管應(yīng)力的影響

圖10?血管應(yīng)力分布

(3) 培養(yǎng)液對血管的壓力分布比較均勻，最大值在入口處為1760Pa，最小在出口處為1500Pa，最值差較小，均值為1640Pa，適合內(nèi)皮細胞生長[25]．壓力從入口方向向出口方向逐漸減小，產(chǎn)生壓力梯度，是培養(yǎng)液流動的動力．

由上述灌注室中支架和血管的流體仿真分析和優(yōu)化結(jié)果，得到了最優(yōu)流量入口和壓力出口，分析表明復(fù)合支架表面流速、剪切應(yīng)力、壓應(yīng)力分布均勻，符合灌注裝置的設(shè)計要求，滿足顱骨復(fù)合支架的生長環(huán)境的要求．驗證了灌注室設(shè)計和灌注裝置提供的流量、壓力的合理性．

4?結(jié)?語

本文研制了一種動態(tài)血液灌注裝置．該裝置具有雙通道流體、氣體循環(huán)，能用于顱骨復(fù)合支架的細胞灌流培養(yǎng)，可模擬人體生理環(huán)境相符的體外培養(yǎng)環(huán)境．根據(jù)細胞生長的需要，建立了流體模型計算剪切應(yīng)力，為流量提供依據(jù)，所得流量可通過PLC對蠕動泵進行精確控制．通過對灌注系統(tǒng)進行有限元優(yōu)化分析，得出流體的壓力、速度和剪切力符合靜脈層流的血流特性，血管應(yīng)力分布較為均勻，同時多孔支架中剪切應(yīng)力、壓力、速度符合顱骨細胞的生長要求．該裝置可系列化設(shè)計，易于裝配，通過修改不同參數(shù)可調(diào)整培養(yǎng)條件，為組織工程支架的動態(tài)培養(yǎng)與體外血管化提供技術(shù)支持．

［1］ Venugopal J，Ramakrishna S. Applications of polymer nanofibers in biomedicine and biotechnology[J]. Appl Biochem Biotechnol，2005，125(3)：147-158.

［2］ Ben-David D，Kizhner T A，Kohler T，et al. Cell-scaffold transplant of hydrogel seeded with rat bone marrow progenitors for bone regeneration[J]. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery，2011，39(5)：364-371.

［3］ Ding M，Henriksen S S，Theilgaard N，et al. Assessment of activated porous granules on implant fixation and early bone formation in sheep[J]. Journal of Orthopaedic Translation，2016，5：38-47.

［4］ Goldstein A S，Juarez T M，Helmke C D，et al. Effect of convection on osteoblastic cell growth and function in biodegradable polymer foam scaffolds[J]. Biomate-rials，2001，22(11)：1279-1288.

［5］ Yeatts A B，F(xiàn)isher J P. Bone tissue engineering bioreactors：Dynamic culture and the influence of shear stress[J]. Bone，2011，48(2)：171-181.

［6］ Liu L，Yuan W，Wang J. Mechanisms for osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells induced by fluid shear stress[J]. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology，2010，9(6)：659-670.

［7］ Volkmer E，Drosse I，Otto S，et al. Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone[J]. Tissue Engineering Part A，2008，14(8)：1331-1340.

［8］ Du D，F(xiàn)urukawa K S，Ushida T. 3D culture of osteoblast-like cells by unidirectional or oscillatory flow for bone tissue engineering[J]. Biotechnol Bioeng，2009，102(6)：1670-1678.

［9］ Frohlich M，Grayson W L，Marolt D，et al. Bone grafts engineered from human adipose-derived stem cells in perfusion bioreactor culture[J]. Tissue Eng Part A，2010，16(1)：179-189.

［10］ Kim D H，Heo S J，Kang Y G，et al. Shear stress and circumferential stretch by pulsatile flow direct vascular endothelial lineage commitment of mesenchymal stem cells in engineered blood vessels[J]. Journal of Materials Science：Materials in Medicine，2016，27：DOI 10.1007/s10856-016-5670-0.

［11］ Santoro R，Olivares A L，Brans G，et al. Bioreactor based engineering of large-scale human cartilage grafts for joint resurfacing[J]. Biomaterials，2010，31(34)：8946-8952.

［12］ Bhaskar B，Owen R，Bahmaee H，et al. Design and assessment of a dynamic perfusion bioreactor for large bone tissue engineering scaffolds[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2018，185(2)：555-563.

［13］ Jagodzinski M，Breitbart A，Wehmeier M，et al. Influence of perfusion and cyclic compression on proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells in 3-dimensional culture[J]. Journal of Biomechanics，2008，41(9)：1885-1891.

［14］ Berner A，Woodruff M A，Lam C X F，et al. Effects of scaffold architecture on cranial bone healing[J]. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery，2014，43(4)：506-513.

［15］ Sinikovic B，Schumann P，Winkler M，et al. Calvaria bone chamber—A new model for intravital assessment of osseous angiogenesis[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2011，99A(2)：151-157.

［16］ 劉潔，鄭淑賢，李佳. 顱骨組織工程血管支架的參數(shù)化設(shè)計[J]. 機械工程學(xué)報，2018，54(1)：178-187.

Liu Jie，Zheng Shuxian，Li Jia. Parametric design for skull tissue engineering vascular scaffold[J]. Chinese Journal of Mechanical Engineering，2018，54(1)：178-187(in Chinese).

［17］ Whittaker R J，Booth R，Dyson R，et al. Mathematical modelling of fibre-enhanced perfusion inside a tissue-engineering bioreactor[J]. Journal of Theoretical Biology，2009，256(4)：533-546.

［18］ Guyot Y，Papantoniou I，Luyten F P，et al. Coupling curvature-dependent and shear stress-stimulated neotissue growth in dynamic bioreactor cultures：A 3D computational model of a complete scaffold[J]. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology，2016，15(1)：169-180.

［19］ 鄒盛銓. 血流動力學(xué)與心血管人工器官[M]. 成都：成都科技大學(xué)出版社，1991.

Zou Shengquan. Hemodynamics and Cardiovascular Artificial Organ[M]. Chengdu：Chengdu University of Science and Technology Press，1991(in Chinese).

［20］ Freitas D，Almeida H A，Bártolo P J. Perfusion bioreactor fluid flow optimization[J]. Procedia Technology，2014，16：1238-1247.

［21］ 喀蔚波. 醫(yī)用物理學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社，2008.

Ka Weibo. Medical Physics[M]. Beijing：Higher Education Press，2008(in Chinese).

［22］ Jeon J H，Jeong O C. Effect of shear stress magnitude on intracellular calcium expression in bone cells[J]. Microelectronic Engineering，2012，97：329-332.

［23］ Sakai K，Mohtai M，Iwamoto Y. Fluid shear stress increases transforming growth factor beta 1 expression in human osteoblast-like cells：Modulation by cation channel blockades[J]. Calcif Tissue Int，1998，63(6)：515-520.

［24］ Xu H，Duan J，Ren L，et al. Impact of flow shear stress on morphology of osteoblast-like IDG-SW3 cells[J]. Journal of Bone and Mineral Metabolism，2018，36：529-536.

［25］ Ho H，Mithraratne K，Hunter P. Numerical simulation of blood flow in an anatomically-accurate cerebral venous tree[J]. IEEE Trans on Med Imaging，2013，32(1)：85-91.

［26］ McCormick S M，Whitson P A，Wu K K，et al. Shear stress differentially regulates PGHS-1 and PGHS-2 protein levels in human endothelial cells[J]. Ann Biomed Eng，2000，28(7)：824-833.

［27］ 畢振慶. 顱骨多孔支架的設(shè)計及其增材制造工藝研究[D]. 天津：天津大學(xué)機械工程學(xué)院，2018.

Bi Zhenqing. Design and Additive Manufacturing for Skull Porous Scaffold[D]. Tianjin：School of Mechanical Engineering，Tianjin University，2018(in Chinese).

［28］ Hu K，Wang C，Zhang X. High pressure may inhibit periprosthetic osteogenesis[J]. Journal of Bone and Mineral Metabolism，2010，28(3)：289-298.

Dynamic Perfusion Device Design for Skull Tissue-Engineered Composite Scaffold

Li Jia，Zhang Chongyue，Zheng Shuxian，Qi Jian，F(xiàn)u Zhiming

(Tianjin Key Laboratory of Equipment Design and Manufacturing Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China)

To solve the problem of low survival rate of cells at the center of a scaffold，a dynamic perfusion culture device is developed for skull composite scaffold with embedded vessels. The device improves cell survival rate and makes composite scaffolds meet the integration requirement in vivo. Based on the structural features of the skull composite scaffold，a double-channel perfusion circulation is designed to separately perfuse porous scaffold and vessels to provide material transmission for osteoblasts and endothelial cells.Moreover，gas circulation provides oxygen and carbon dioxide for circulating culture medium，which ensures sufficient oxygen and stable pH. To simulate the mechanical environment in a natural human skull，a porous scaffold and a vascular fluid model are established，and the shear stress is calculated according to the inlet flow rate of perfusion chamber and vessel. Therefore，the control range and accuracy of fluid flow and pressure are determined，and the suitable flow rate for composite scaffolds are obtained. An orthogonal test with three factors and three levels is designed to optimize the size and determine the key parts of the perfusion chamber structure. The whole structure of the dynamic perfusion device is installed by connecting the perfusion chamber，the liquid storage bottle，and the peristaltic pump with a silica gel tube to form a circulating system. A finite element fluid analysis model is established to analyze the effect of flow with different velocities on composite scaffold. The results show that the fluid velocity，shear stress，and pressure are uniformly distributed in the perfusion chamber and vessel，and the physiological environment of bone tissue and endothelial cells is satisfactorily simulated；therefore，the rationality of the device is verified. The device can be used for dynamic cell culture of bone tissue in vitro. It lays a foundation for the construction and vascularization of bone tissue-engineered scaffolds.

skull；tissue engineering；composite scaffold；dynamic perfusion；fluid model

10.11784/tdxbz201808026

TH79

A

0493-2137(2019)05-0459-09

2018-08-06；

2018-10-05.

李佳（1955— ），男，博士，教授，jli@tju.edu.cn.

鄭淑賢，sxzheng@tju.edu.cn.

國家自然科學(xué)基金資助項目(51575380).

the National Natural Science Foundation of China(No. 51575380).

(責(zé)任編輯：金順愛)