p38 MAPK信號通路與糖皮質激素抵抗型哮喘的關系

穆凱代斯·賽迪，楊曉紅

(1.新疆醫(yī)科大學,烏魯木齊 830011； 2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，烏魯木齊 830001)

支氣管哮喘(哮喘)是一種嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞等細胞以及細胞組分共同參與，以可逆性氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，影響著不同國家中1%～18%人口的健康[1]。糖皮質激素(glucocorticoids，GC)是目前國際上公認的治療哮喘最主要的藥物，已被臨床普遍應用。從哮喘患者目前的治療狀況來看，臨床上有些哮喘患者對治療藥物的敏感性有所下降，有些患者即便長期規(guī)律使用激素并且接受規(guī)范治療，療效仍然欠佳[2]，有些患者甚至對激素藥物抵抗。1968年，Schwartz等[3]第一次提出激素抵抗型哮喘(steroid-resistant asthma,SRA)的概念，1981年，Carmichael等[4]根據GC受體治療后第1秒用力呼氣容積的改善率將哮喘分為SRA和激素敏感型哮喘(steroid-sensitive asthma,SSA)。臨床上一般將這類在呼吸科醫(yī)師指導下和保障依從性并且用藥規(guī)范的前提下對激素治療不敏感，口服潑尼松龍(劑量≥40 mg/d)治療1～2周后，第1秒用力呼氣容積改善不超過15%的哮喘稱之為SRA。這類患者療效欠佳，疾病進展速度快，病情嚴重。抵抗的發(fā)生機制尚不完全清楚，國內外研究發(fā)現(xiàn)，p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)亞型在SRA的發(fā)病過程中起重要作用，p38 MAPK亞型的抑制劑能逆轉SRA患者對激素的敏感性[5]，現(xiàn)對p38 MAPK信號通路及其與SRA患者關系的國內外研究進行綜述。

1 MAPK及p38 MAPK信號轉導途徑及其作用

細胞對細胞外刺激的反應是由許多細胞內激酶和磷酸酶介導的。MAPK是各種細胞外刺激的焦點，被不同的細胞外刺激，如細胞因子、激素、細胞應激等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。MAPK是將信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘炔康闹匾獋鬟f者，一般將MAPK分為3個亞型：細胞外調節(jié)蛋白激酶、p38、c-Jun氨基端激酶。MAPK的組成是一種保守的三級激酶模式，包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶、MAPK[6-10]，這3種激酶能依次激活，共同調節(jié)著細胞的生長、分化、應激和炎癥反應等重要的細胞生理和病理過程。

p38由4種亞型(p38α、p38β、p38γ和p38δ)組成，它們通過上游激酶的磷酸化底物調節(jié)細胞活性。p38組激酶被雙激酶激活，即為MAPK激酶，并且磷酸化其下游底物的特定絲氨酸和蘇氨酸。p38通路被促炎因子、細菌病原體及其代謝產物磷酸化激活，激活后的p38 MAPK由胞質進入細胞核內，活化轉錄因子，調節(jié)特定的基因表達參與應激條件下細胞的免疫炎癥反應及細胞生長、細胞分化、細胞周期和細胞死亡過程[11-14]。p38在炎癥中通過以下方面起著重要作用：①產生促炎細胞因子，如白細胞介素(interleukin,IL)1b、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6[4]；②誘導環(huán)加氧酶2等酶[15]，控制病理狀態(tài)下的結締組織重塑；③調節(jié)氧化作用的細胞內酶(如一氧化氮合酶)[16]的表達；④誘導黏附蛋白(如血管細胞黏附分子1)和許多其他炎癥相關分子[17]。

2 GC的作用

GC是哮喘等幾種疾病的有效抗炎藥,能有效控制大多數患者的哮喘，但仍有少數患者對其反應性較差，需要吸入或口服高劑量的GC，其中一小部分患者表現(xiàn)出對GC完全抵抗。GC可以抑制其他轉錄因子，如激活蛋白1和核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)，通過直接的蛋白質-蛋白質相互作用激活NF-κB等的靶基因，這種作用被稱為轉錄抑制。此外，GC還可以在抑制促炎激酶級聯(lián)系統(tǒng)的作用中發(fā)揮作用。

2.1激活抗炎基因表達GC GC通過與細胞質GC受體結合起作用，兩者結合后轉運至細胞核。在細胞核內，GC受體作為二聚體與類固醇敏感基因的啟動子區(qū)域內DNA上特定的GC反應元件結合，并且直接或間接與共激活因子分子(如環(huán)腺苷酸效應元件結合蛋白)結合[14,18]，p300/環(huán)腺苷酸效應元件結合蛋白活化因子或類固醇受體輔激活因子2具有內在的組蛋白乙酰轉移酶活性，導致組蛋白H4上的賴氨酸乙?；瑢е戮幋a抗炎蛋白的基因活化，如分泌性白細胞蛋白酶抑制劑、促分裂原活化的蛋白激酶磷酸酶1(mitogen activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)、NF-κB抑制劑。這些基因編碼細胞因子、趨化因子、炎癥酶和受體中的黏附分子，通過與轉錄共激活因子相互作用以與GC受體介導的基因轉錄相似的方式被激活?；罨腉C受體與共抑制因子分子相互作用，以減弱NF-κB相關的共激活因子活性，進一步通過激活的GC受體將組蛋白去乙酰化酶2特異性募集到激活的基因復合物中，從而減少組蛋白乙酰化，有效抑制細胞核內炎癥基因的激活[14]。

2.2抑制Th2細胞 GC治療哮喘等過敏性疾病的另外一個重要作用是通過抑制Th2細胞和Th2細胞因子(IL-2、IL-4、IL-5和IL-13)實現(xiàn)的。該過程由轉錄因子GATA3介導，p38 MAPK磷酸化后，輸入蛋白α將GATA3從細胞質轉移至細胞核[19]。因GC受體與輸入蛋白α競爭核輸入，并且誘導MKP-1逆轉p38 MAPK對GATA3的磷酸化，GC有效抑制了GATA3核轉位。

3 SRA與p38 MAPK的關系

3.1p38 MAPK參與發(fā)生激素抵抗的環(huán)節(jié) 激素抵抗是包括哮喘在內的很多慢性炎癥性疾病共同存在的問題。相比SSA，SRA患者的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中p38活化選擇性增加，p38 MAPK過度活化已被認為是SRA的一種機制。

3.1.1SRA與促炎因子 p38 MAPK被細菌病原體及其代謝產物等磷酸化激活，在疾病嚴重的情況下，大量產生促炎細胞因子、趨化因子、生長因子和自由基，從而使MAPK大量活化，導致GC作用減弱。Bhavsar等[20]用脂多糖刺激不同嚴重程度哮喘患者的肺泡巨噬細胞，并得出結論：類固醇反應性與p38 MAPK活化程度相關，哮喘的臨床嚴重程度與哮喘患者氣道中磷酸化p38的表達之間存在關聯(lián)。p38 MAPK可以調節(jié)許多促炎細胞因子的產生，例如IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、TNF-α。另外一些研究在SRA患者的支氣管肺泡灌洗液中檢測到與經典巨噬細胞活化相關的多種炎癥基因的表達，且IL-2、IL-4、IL-8和TNF-α水平升高[21-22]。有研究通過將PBMC與IL-2/IL-4一起孵育，在體外誘導GC受體親和力降低。細胞與IL-2和IL-4的聯(lián)合處理導致促炎細胞因子的表達增加和抗炎細胞因子IL-10等的表達降低。在用IL-2和IL-4預處理的PBMC中，GC調節(jié)IL-10的產生和抑制脂多糖刺激的促炎細胞因子釋放的能力降低[23]。這表明有利于促炎狀態(tài)的細胞因子產生的平衡可能影響哮喘嚴重程度。這種作用的分子基礎可能是IL-2/IL-4可通過細胞核內的p38 MAPK使絲氨酸殘基(可能是絲氨酸226)磷酸化改變GC受體的功能和活性。這些細胞因子體外組合不僅可降低單核細胞核內的GC受體核轉位和結合能力，還可以通過p38磷酸化轉錄因子GATA3，從而促進Th2的激活并且降低對GC敏感性[24]。

3.1.2SRA與基因 Vingerhoeds等[25]對大約30例患有皮質醇耐藥的患者和無癥狀家庭成員中8例患者進行分子基礎鑒定，發(fā)現(xiàn)其中7例患者GC受體基因激素結合域的突變是控制皮質醇抗性臨床癥狀的原因、1例患者顯示DNA結合結構域的突變。SRA患者存在家族聚集現(xiàn)象，提出了該病具有基因遺傳性。Hakonarson等[23]分別從SRA和SSA患者外周血細胞里鑒別出L78440等多個基因。在后期研究中發(fā)現(xiàn)家族性SRA患者的外周血細胞中GC受體突變引起GC受體功能異常,但在非家族性的SRA中沒有發(fā)現(xiàn)GC受體突變。然而Matthews等[24]發(fā)現(xiàn)SRA患者的GC受體3.2結合和轉移位點缺失，導致IL-2和IL-4的表達顯著增高，IL-2和IL-4通過p38 MAPK通路使GC受體磷酸化，從而降低GC受體的核轉移和與DNA結合的能力以及GC的抗炎作用，引起對GC治療的不敏感。

3.1.3SRA與MKP-1 MKP-1是MKP家族的一員，在炎癥反應中起關鍵作用。MKP-1作為MAPK的一個負調控因子，可以使MAPK去磷酸化從而失活。既往研究發(fā)現(xiàn)，健康小鼠肺組織中p38 MAPK和MKP-1低表達或不表達，在炎癥刺激作用下表達有上調[8]。MKP-1基因敲除小鼠的巨噬細胞由于MAPK活化增加而在體外顯示對GC的抗炎反應降低。早前Abraham等[26]發(fā)現(xiàn)SRA與SSA患者肺泡巨噬細胞p38 MAPK的激活程度有差異。與SSA患者相比，SRA患者的PBMC中p38 MAPK的激活明顯增加[27]，有研究將MKP-1定為體外對皮質類固醇治療反應的標志物[28]。Milara等[29]在最近研究中觀察到SRA患者的中性粒細胞和支氣管上皮細胞中MKP-1表達較SSA降低。SRA患者使用GC后肺泡巨噬細胞中MKP-1表達顯著降低，這與通過p38 MAPK途徑使GC受體磷酸化，導致肺泡巨噬細胞MKP-1表達明顯減少，從而降低了GC受體向細胞核內轉移以及與細胞核DNA結合的能力有關。

3.1.4SRA與1,25-二羥維生素D Zhang等[30]將11例SRA患者和8例SSA患者的外周血細胞用1,25-二羥維生素D預孵育，然后給予地塞米松治療和脂多糖刺激。通過流式細胞術，實時聚合酶鏈反應分析等方法分別檢測單核細胞中脂多糖誘導的磷酸化p38，MKP-1 信使RNA的表達。結果發(fā)現(xiàn)維生素D在SRA患者和SSA患者的單核細胞中表現(xiàn)出抗炎和皮質類固醇增強作用。然而，SRA患者對皮質類固醇的反應強度仍顯著低于SSA患者。一項研究證明1,25-二羥維生素D在抑制脂多糖誘導的p38 MAPK活化和促炎細胞因子產生的同時能刺激單核細胞MKP-1表達[31]。維生素D缺乏時p38 MAPK活化抑制或促進MKP-1表達的作用減弱，從而減少對GC的反應性。

3.1.5SRA與絲裂原和應激激活蛋白激酶1(mitogen and stress-activated protein kinase 1,MSK1) p38的下游存在MSK1，MSK1在不同的炎癥基因啟動子處刺激絲氨酸上的組蛋白H3的磷酸化以刺激炎癥基因的轉錄。GC在激活炎癥基因啟動子時抑制活化的MSK1的募集，從而抑制NF-κB、p65交換以及組蛋白H3磷酸化。NF-κB是許多促炎細胞因子和免疫基因的主要調節(jié)因子(包括TNF-α、IL-8等)，在細胞受刺激時，NF-κB移位至細胞核并介導基因轉錄，它由DNA結合Rel蛋白家族的異二聚體或同二聚體組成[32]。GC受體可以通過抑制NF-κB來減少炎癥。p38 MAPK激活后增強組蛋白H3磷酸化，使GC受體不能有效抑制NF-κB，影響NF-κB在炎癥反應的各個階段調控炎性介質的作用。此外，MSK1主要定位于細胞核，磷酸化的GC受體可以將磷酸化MSK1從細胞核轉移到細胞質，從而抑制MSK1對其下游靶標的影響。

綜上所述，NF-κB依賴性及其他炎癥基因的過度表達，GC受體的過度磷酸化、受體對GC的結合親和力及GC受體核轉位減少，組蛋白H3磷酸化會降低GC的抗炎作用，引起對GC受體治療的抵抗性，而以上過程均有p38 MAPK途徑的參與。

3.2p38 MAPK抑制劑在SRA中的作用 激素抵抗是哮喘治療中的重大挑戰(zhàn)，一般SRA對GC受體的治療無效，治療通常以支氣管擴張藥物和其他免疫調節(jié)藥物等為主。隨著人們對p38 MAPK的研究及認識的加深，發(fā)現(xiàn)通過使用p38 MAPK抑制劑可改善SRA患者對皮質類固醇的敏感性，也可治療許多其他疾病，如動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、抑郁癥、免疫疾病等。

第一代p38 MAPK抑制劑以吡啶基咪唑抑制劑SB203580為代表，在小鼠哮喘模型中能夠抑制過敏原誘導的TNF-α的增加，但在致敏小鼠中不能抑制卵清蛋白誘導的嗜酸粒細胞增多或中性粒細胞增多[33]。Laufer等[34]發(fā)現(xiàn)哮喘患者支氣管上皮中黏蛋白5AC分泌量增多，p38 MAPK信號通路在黏蛋白5AC合成過程中的重要作用，阻斷該通路可防止氣道黏液高分泌。但是，體外SB203580處理不僅對巨噬細胞功能有抑制作用，還具有肝毒性和致癌可能性[35]，因此不再用于p38 MAPK抑制研究，從而開發(fā)出具有更高效力和選擇性的第二代化合物SB239063。與SB203580相比，SB239063對p38 α、p38 β的選擇性和效力的提高，對γ和δ沒有抑制活性。相比沒有加SB239063，SB239063能在小鼠哮喘模型中使卵清蛋白致敏的小鼠中氣道嗜酸粒細胞增加量減少93%[36]，還顯著降低了過敏原誘導的Th2細胞因子和卵清蛋白特異性IgE的增加。p38 MAPK抑制劑在抑制促炎癥細胞因子的同時也可能抑制關鍵的抗炎蛋白，如三睪丸素的表達。三睪丸素是一種RNA結合蛋白，可促進許多蛋白質信使RNA的衰變，包括那些在慢性呼吸道疾病中起作用的蛋白質。p38 MAPK抑制劑有望用于目前可用的SRA藥物的附加治療[5,37]。p38 MAPK抑制劑具有比GC受體更廣泛的抗炎作用，與GC受體可能產生協(xié)同效應。此外，p38 MAPK抑制劑甚至有望恢復SRA患者中的皮質類固醇敏感性。

4 結 語

SRA發(fā)病機制復雜，仍然是哮喘研究中的難點。p38 MAPK在SRA發(fā)病中起著重要作用，p38 MAPK抑制劑可以增強細胞對GC受體的反應性，甚至可以逆轉激素抵抗。p38 MAPK直接或間接參加調節(jié)體內許多生理反應過程。p38 MAPK抑制劑可以作為恢復GC受體敏感性的新策略，但是抑制p38 MAPK通路在減輕激素抵抗，增強細胞對GC受體的反應性的同時，存在一些潛在的藥物安全性問題，因此安全性、選擇性更高的p38 MAPK抑制劑，能為SRA患者診療帶來新的方向。