彭馨儀 羅新華

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州省人民醫(yī)院感染科，貴州 貴陽 550002)

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是各種化學(xué)藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥等誘發(fā)的肝損傷，是最常見和最嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)(adverse reactions to drug，ADR)之一，占我國(guó)急性肝損傷住院比例的20%[1-2]?，F(xiàn)階段研究顯示，DILI的發(fā)病機(jī)制主要概括為藥物的直接肝毒性和特異質(zhì)性肝毒性，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為參與細(xì)胞生物合成、解毒和Ca2+儲(chǔ)存的重要細(xì)胞器，其功能紊亂對(duì)藥物性肝損傷的發(fā)生是否有影響目前少有報(bào)道。探討藥物性肝損傷發(fā)病的具體機(jī)制，對(duì)尋找更有效的防治措施有積極意義。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)動(dòng)物：SPF級(jí)Wister大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(150±10) g，購于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(黔)2012-0001。(2)藥品與試劑：異煙肼片(成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司)100mg/片，β肌動(dòng)蛋白(β-non-muscle，β-Actin)、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)、Caspase-12一抗抗體(英國(guó)abcam公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗(武漢博士得生物科技公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(roche In situ cell death detection kit，POS)、蛋白酶K(瑞士Roche公司)，ECL發(fā)光液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染料(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，組織裂解液(碧云天)，DAB顯色液(索萊寶)等。(3)儀器：ChemiDocTMTouch Imaging System(732BR0475，美國(guó)伯樂)，分光光度計(jì)(1510，美國(guó)賽默飛世爾科技)，雙垂直電泳儀(DYCZ-24EN型，北京市六一儀器廠)，徠卡顯微鏡(DM500，德國(guó)徠卡)，轉(zhuǎn)移脫色搖床(TS-8，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，三用水箱(600型，金壇市富華儀器有限公司)，臺(tái)式低速冷凍離心機(jī)(L530R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(Microfuge 20R，德國(guó))，微量移液器(德國(guó)Eppendorf)等。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 模型組大鼠體質(zhì)量比對(duì)照組增長(zhǎng)慢。隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組出現(xiàn)被毛蓬松、脫落，進(jìn)食量減少，反應(yīng)遲鈍，肝指數(shù)增加，給藥11 d后出現(xiàn)部分大鼠死亡。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)

注：*與對(duì)照組比較P<0.05，△與對(duì)照組比較P<0.01。

2.2血生化變化 與對(duì)照組比較，模型組ALT、AST均增高，造模7 d后開始模型組與對(duì)照組間ALT、AST差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)改變

注：*與對(duì)照組比較P<0.05，△與對(duì)照組比較P<0.01。

2.3病理形態(tài)學(xué)變化 模型組大鼠肝組織在用藥3 d后未見明顯異常改變；7 d時(shí)可見肝細(xì)胞胞漿疏松化，肝小葉有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；10 d時(shí)出現(xiàn)灶狀壞死，肝竇變窄；14 d可見肝束排列紊亂，肝竇狹窄，輕至重度胞漿疏松化，壞死灶增多；21 d出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝竇狹窄，肝細(xì)胞廣泛壞死，伴有肝細(xì)胞再生。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)變化(HE染色，100×)

2.4異煙肼對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，對(duì)照組均無明顯凋亡，模型組給藥3 d凋亡細(xì)胞較少，給藥7 d凋亡細(xì)胞增多，在14 d達(dá)到高峰，此后維持在較高水平，見圖2。模型組凋亡指數(shù)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.38，P<0.01)。見表3。

圖2 各組大鼠肝組織凋亡細(xì)胞檢測(cè)(TUNEL法，400×)

區(qū)組視野凋亡指數(shù)(%)NGINH3 d80.80±0.110.82±0.127 d80.62±0.103.28±0.80△10 d80.73±0.137.01±1.12▲14 d80.68±0.158.16±1.45▲21 d80.70±0.167.52±1.29▲

注：△與對(duì)照組比較P<0.05，▲與對(duì)照組比較P<0.01。

2.5異煙肼對(duì)大鼠肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP、Caspase-12表達(dá)的影響 運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組大鼠肝組織中CHOP、Caspase-12的相對(duì)表達(dá)值，結(jié)果顯示，對(duì)照組CHOP、Caspase-12呈低表達(dá)，但各對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，模型組CHOP、Caspase-12明顯增高，在14 d表達(dá)量最大，21 d較14 d下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CHOP：F=12.36，P<0.05；Caspase-12，F(xiàn)=26.65，P<0.01)。見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP的表達(dá)

圖4 各組大鼠肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白Caspase-12的表達(dá)

3 討 論

藥物性肝損傷是宿主、藥物及環(huán)境等多危險(xiǎn)因素參與、多機(jī)制先后或共同作用引發(fā)的一類疾病，在臨床工作中多數(shù)病例不可預(yù)測(cè)，該病無論從其診斷還是治療上來說都是肝病領(lǐng)域中一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的疾病[4]。DILI作為藥物安全性問題的重要組成部分，已成為過去半個(gè)多世紀(jì)藥物撤市的最常見原因，因此，藥物的肝臟毒性正日益受到醫(yī)學(xué)界、社會(huì)公眾和藥監(jiān)部門的廣泛關(guān)注和重視[5]。

本課題組使用異煙肼灌胃大鼠的方法建立藥物性肝損傷動(dòng)物模型，通過對(duì)比對(duì)照組與模型組大鼠的血清酶學(xué)、病理形態(tài)學(xué)、凋亡指數(shù)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，證明ERS凋亡蛋白CHOP、Caspase-12的高表達(dá)可能通過誘導(dǎo)過度的肝細(xì)胞凋亡引發(fā)肝損傷，這與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡是肝損害及肝纖維化的主要?jiǎng)右蛳喾?。?nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是由生物膜構(gòu)成的互相通連的片層隙狀或小管狀系統(tǒng)，存在于除哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞外的各種真核細(xì)胞中，與糖類和脂類的合成、解毒、同化作用有關(guān)，還參與運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)，能分解甾體、滅活藥物和毒物并使其能被排出體外，當(dāng)內(nèi)外因素刺激肝臟、破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)時(shí)，可引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使蛋白質(zhì)的合成受到抑制，促使未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)降解，這有利于減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白負(fù)荷，恢復(fù)其穩(wěn)態(tài)，從而維持細(xì)胞的正常功能，但持續(xù)、強(qiáng)烈的ERS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引發(fā)組織損傷[7-8]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生凋亡的標(biāo)志性蛋白，它主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路PERK/eIF2a-CHOP途徑和ATF6-CHOP途徑激活。CHOP基因的大量表達(dá)，可激活其多條下游凋亡通路，可引起細(xì)胞鈣超載，激活Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X，Bax)，誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡[9-10]。CHOP還可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過量的活性氧族(reactive oxygen species，ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷[11]。Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性凋亡蛋白，只與ERS 介導(dǎo)的凋亡有關(guān)，在外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體凋亡途徑中不被活化。激烈或/和持續(xù)的ERS可引起Caspase-12的激活，激活的Caspase-12進(jìn)一步切割激活Caspase-9，繼而激活Caspase-3等一系列效應(yīng)Caspases，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。在本研究中，模型組給藥21 d后其CHOP、Caspase-12表達(dá)較14 d下降，凋亡指數(shù)降低，但大鼠的病理損傷較重，這一現(xiàn)象可能與肝損傷進(jìn)展中其他致?lián)p傷因素介入有關(guān)。趙雄等[10]研究證實(shí)：ERS可以通過協(xié)同活化的cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白H(CREBH)調(diào)節(jié)C反應(yīng)蛋白水平進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞炎癥。還有研究指出，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡可能是肝衰的早期病因，后期以壞死為主[11]。

本研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡蛋白CHOP、Caspase-12的過表達(dá)與肝臟細(xì)胞凋亡變化趨勢(shì)一致，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的過度凋亡可能是藥物性肝損傷發(fā)生的重要機(jī)制，特別是在DILI的早期，是否能通過及時(shí)緩解過激的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到改善藥物性肝損傷預(yù)后的目的有待于進(jìn)一步研究。