安薈羽，唐成林，黃思琴，趙丹丹，羅翱，吳夢佳，譚程方，邱麗，萬小鳳，馬翔

1.重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，重慶市400016；2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市400016

肌肉纖維的形成以及肌肉運動的發(fā)生依賴于周圍神經(jīng)元的正常工作[1]。周圍神經(jīng)損傷后，骨骼肌失去神經(jīng)支配，進而缺失營養(yǎng)導致肌肉收縮功能、反應(yīng)能力喪失，體積變小，發(fā)生萎縮[2]。去神經(jīng)支配誘導的肌肉廢用可激活肌肉中的自噬信號傳導途徑，細胞自噬活性升高，清除受損胞質(zhì)和細胞器[3]。細胞自噬對保持肌肉質(zhì)量和肌纖維的完整性非常重要[4]。馬書杰等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，推拿手法在一定程度上可促進骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖并分化為成熟肌纖維，延緩失神經(jīng)后骨骼肌萎縮。說明推拿對延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮有效，但其具體機制還需要進一步研究。

本課題組前期研究[7-9]表明，電針在失神經(jīng)后期(8周)可能通過調(diào)控自噬相關(guān)基因表達，抑制自噬過度激活，從而維持骨骼肌細胞穩(wěn)態(tài)，延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮，也可通過抑制肌細胞的凋亡、促進肌衛(wèi)星細胞增殖，來延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮。

本研究觀察推拿在不同時間點對前期失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌中自噬相關(guān)基因Beclin-1、液泡分選蛋白34(vacuolar protein sorting,Vps34)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)的影響，從自噬活性水平變化的角度，探討推拿延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的可能機制，為臨床上運用推拿治療失神經(jīng)導致的肌萎縮提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠77只，體質(zhì)量(220±10)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物合格證號SCXK(川)2015-030，代養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心ⅠVC級動物房。實驗過程中對動物的處理完全符合重慶醫(yī)科大學醫(yī)學研究倫理委員會標準。

1.2 主要試劑與儀器

Beclin-1、 Vps34、 LC3、 β-actin 引 物 合 成 、RR037A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNAiso Plus試劑、SYBR?Premix Ex Taq TMⅡ：日本TAKARA公司。DEPC水：碧云天生物科技有限公司。大鼠柔性固定器：溫州原上草醫(yī)療科技有限公司。AFY-10型小動物按摩器：天津。CellSens Standard圖像采集軟件和BX53普通正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。AL204型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。低溫高速離心機：日本SⅠGMA公司。Thermo ND 2000超微量核酸蛋白測定儀：上海GENE公司。CFX PCR檢測系統(tǒng)、T100TMPCR儀：美國BⅠO RAD公司。

1.3 模型制備及分組

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，依次編為1～77號，用計算機自動生成77個兩位數(shù)隨機數(shù)字表，每一個編號對應(yīng)一個隨機數(shù)字，然后按隨機數(shù)字大小重新排列序號，序號1～7作為假手術(shù)組(n=7)，8～42作為模型組(n=35)，43～77作為推拿組(n=35)。

模型組和推拿組4%水合氯醛0.8 ml/100 g腹腔注射麻醉，俯臥固定在手術(shù)臺，在無菌條件下右后肢手術(shù)區(qū)消毒備皮，右后肢股后外側(cè)作切口，鈍性分離股二頭肌，玻璃分針分離脛神經(jīng)，眼科剪剪斷1.0 cm，造成神經(jīng)缺損，逐層縫合，傷口消毒[10]。

假手術(shù)組只暴露神經(jīng)，不離斷神經(jīng)。

1.4 干預方法

造模后第2天，推拿組于每天14：00進行干預。用大鼠柔性固定器固定大鼠，待其情緒穩(wěn)定后，將小動物按摩器按摩頭固定于大鼠術(shù)側(cè)下肢，讓按摩頭對萎縮肌肉進行推拿干預，設(shè)置按摩頭轉(zhuǎn)速2600 r/min，推拿時間15 min，每天1次[11]。假手術(shù)組和模型組每天只固定，排除固定時的應(yīng)激反應(yīng)所導致的誤差。

1.5 標本采集

假手術(shù)組在第28天取材，模型組和推拿組分別在造模后第0、7、14、21、28天隨機各取7只大鼠取材。大鼠稱重，4%水合氯醛0.8 ml/100 g腹腔注射麻醉，快速完整剝離腓腸肌，PBS緩沖液清洗，吸干表面殘留液體，電子天平稱重，并仔細觀察腓腸肌萎縮情況(肌肉彈性、色澤和飽滿度)。稱重后將取下的腓腸肌分為兩份，一份用肌肉固定液固定，用于形態(tài)學檢測；一份放入液氮罐中凍存，-80℃冰箱保存待測。0 d組在術(shù)后待其麻醉效果失效轉(zhuǎn)醒，確認無死亡且造模成功后即刻取材，不做任何干預。

1.6 指標檢測

1.6.1 腓腸肌濕重比

取材時迅速完整剝離雙側(cè)腓腸肌，以近端于股骨內(nèi)、外髁起點剪下，遠端于跟腱止點處剪斷為準，清除表面血管和神經(jīng)，電子天平稱重，以自身體質(zhì)量作為對照，計算腓腸肌濕重比。

1.6.2 肌纖維截面積和直徑

將肌肉固定液固定后的腓腸肌，乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，在400×光學顯微鏡下觀察，每張切片隨機采取5個視野的圖像，通過Ⅰmage Pro Plus 6.0分析軟件分析圖像并計算腓腸肌肌纖維截面積和直徑。

1.6.3 逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測腓腸肌Beclin-1、Vps34和LC3 mRNA表達

從-80℃冰箱中取出腓腸肌組織樣本約50 mg，加入Trizol，勻漿，加氯仿，離心，提取上清液；加異丙醇靜置后離心，酒精清洗3次后晾干，加入DEPC水；在超微量核酸蛋白測定儀上檢測總RNA濃度和純度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟配置反應(yīng)體系，于T100TMPCR儀中進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；SYBR Green法配置反應(yīng)體系，加樣，上機，進行RT-qPCR反應(yīng)。采用CFX manager 3.1 軟件讀取Ct值。計算2-△△Ct。上下游引物序列見表1。

1.7 統(tǒng)計學分析

表1 待測基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌濕重比

組間比較，三組0 d時腓腸肌濕重比無顯著性差異(P＞0.05)；其他時間點，模型組和推拿組均較假手術(shù)組下降(P＜0.05)，推拿組除21 d外，腓腸肌濕重比均高于模型組(P＜0.05)。組內(nèi)比較，模型組和推拿組腓腸肌濕重比隨時間進行性顯著下降(P＜0.001)，術(shù)后0 d最大，28 d最小。見表2。

2.2 形態(tài)學

假手術(shù)組與其他組0 d術(shù)側(cè)腓腸肌纖維形態(tài)正常，邊緣規(guī)則；其余各時間各組肌纖維隨時間延長呈縮小趨勢，邊緣不規(guī)則，推拿組較模型組肌纖維大且邊緣較規(guī)則。

表2 各組腓腸肌濕重比比較(×10-3)

表3 各組肌纖維截面積比較(μm2)

三組0 d時肌纖維截面積和直徑無顯著性差異(P＞0.05)。其他時間點，與假手術(shù)組比較，模型組和推拿組(除推拿組7 d)均下降(P＜0.05)，推拿組(除7 d)均高于模型組(P＜0.05)。組內(nèi)比較，模型組截面積和直徑隨時間進行性顯著下降(P＜0.001)，14 d與21 d組無顯著性差異(P＞0.05)；推拿組截面積在14 d后進行性顯著下降(P＜0.001)，直徑在21 d后進行性顯著下降(P＜0.001)。見圖1，表3、表4。

2.3 RT-qPCR

三組0 d時各項Beclin-1、Vps34和LC3的mRNA表達均無顯著性差異(P＞0.05)。其他時間點，與假手術(shù)組比較，模型組術(shù)側(cè)腓腸肌Beclin-1 mRNA(除14 d)、Vps34 mRNA(除7 d)表達均升高(P ＜ 0.05)，模型組21 d LC3 mRNA表達升高(P＜0.05)；推拿組Be-clin-1、Vps34 mRNA表達以及LC3 mRNA表達(除14 d)均升高(P＜0.05)，推拿組各項mRNA表達(除14 d以及Vps mRNA 28 d組)均高于模型組(P＜0.05)。

組內(nèi)比較，隨實驗時間延長，模型組Beclin-1和Vps34 mRNA表達在21 d后呈上升趨勢(P＜0.05)，LC3 mRNA表達在21 d升高(P＜0.05)；推拿組Beclin-1 mRNA表達呈先上升后下降的趨勢(P＜0.05)，Vps34和LC3 mRNA表達(除14 d)呈先上升后下降的趨勢(P＜0.05)，術(shù)后0 d最小。見表5～7。

表4 各組肌纖維直徑比較(μm)

表5 各組術(shù)側(cè)腓腸肌Beclin-1 mRNA表達比較(2-△△Ct)

表6 各組腓腸肌Vps34 mRNA表達比較(2-△△Ct)

表7 各組腓腸肌LC3 mRNA表達比較(2-△△Ct)

3 討論

中醫(yī)將各種類型的肌萎縮歸為“痿證”的范疇，失神經(jīng)肌萎縮急性期屬于氣滯血瘀型，恢復期則屬于各種虛癥如氣血虧虛、肝腎不足等。傳統(tǒng)中醫(yī)理論將推拿的作用原理概括為平衡陰陽、調(diào)和臟腑、疏通經(jīng)絡(luò)、行氣活血等[12]，可防治失神經(jīng)肌萎縮。

骨骼肌失神經(jīng)后，會導致肌細胞凋亡、肌肉蛋白質(zhì)降解大于合成、失去營養(yǎng)因子的營養(yǎng)作用及生理電刺激、神經(jīng)-肌肉接頭處運動終板退化、肌衛(wèi)星細胞耗竭、骨骼肌毛細血管退化，造成肌組織相對缺氧，線粒體和各種酶變化等[13-14]。這些都是失神經(jīng)骨骼肌萎縮的發(fā)病機制，其中失神經(jīng)后失去營養(yǎng)因子的營養(yǎng)作用會使細胞自噬的活性升高。

圖1 各組大鼠腓腸肌不同時間點HE染色(bar=50μm)

推拿是臨床治療失神經(jīng)性肌萎縮的常見療法，效果顯著。郭汝寶等[15-17]的研究表明，推拿手法早期可促進腓腸?、裥图∏虻鞍字劓?myosin heavy chain,MHC-Ⅰ)與MHC-Ⅱ的相對表達量增加，改善骨骼肌結(jié)構(gòu)改建能力；促進肌衛(wèi)星細胞的增殖和胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,ⅠGF-Ⅰ)表達；增加復合肌肉動作電位波幅、收縮力和收縮位移，改善復合動作電位和收縮功能，延緩骨骼肌失神經(jīng)后肌萎縮，促進骨骼肌再生修復。而本實驗發(fā)現(xiàn)推拿能夠促進細胞自噬活性，清除損傷細胞器和蛋白質(zhì)，為肌纖維再生提供一定的合成底物和能量，從而減輕失神經(jīng)骨骼肌萎縮的程度。

自噬是細胞自我消化、降解和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制[18]。在正常的生理條件下，細胞自噬保持基礎(chǔ)水平，以維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；營養(yǎng)缺乏和能量不足的條件下，一部分細胞質(zhì)和細胞器被包裹進自噬體，自噬體再與溶酶體融合成自噬溶酶體，受損的胞質(zhì)和細胞器等大分子物質(zhì)被降解為核苷酸、氨基酸、游離脂肪酸等小分子物質(zhì)，被重新利用合成大分子或能量物質(zhì)ATP[19]。這個過程可以使機體在嚴峻的生存條件下通過自我降解以提供能量和營養(yǎng)成分保證生存，同時也可以清除侵入體內(nèi)的病原體[18]。參與自噬過程的基因主要指一系列的自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene,Atg)。哺乳動物Beclin-1是酵母Atg6/Vps30基因的同源物，主要定位于反面高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，能介導其他自噬蛋白質(zhì)定位于自噬前體[20]。Vps34與Beclin-1、Vps15形成Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶復合物(phosphatidylinositol 3-kinase ClassⅢcomplex,PⅠ3KC3)，可磷酸化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PⅠ)，生成 3-磷酸磷脂酰肌醇(PⅠ3-phosphate,PⅠ3P)，而PⅠ3P募集胞漿中其他自噬相關(guān)蛋白Atg結(jié)合到自噬前體膜上，在自噬體形成早期發(fā)揮重要的作用[21]。LC3參與自噬體膜的形成，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式，細胞內(nèi)新合成的LC3經(jīng)過剪切修飾成為胞漿可溶形式的LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化加工修飾，與自噬體膜表面的PE結(jié)合成為膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ；LC3-Ⅱ定位于自噬前體和自噬體，隨著自噬體膜的增多而上調(diào)，是自噬體的標志分子[22]。LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)，其含量或比值下降提示自噬活性降低，反之提示活性升高[23]。

邱守濤等[24]發(fā)現(xiàn)在SAMP6快速衰老小鼠模型中，降解機制障礙導致自噬水平降低，這可能參與骨骼肌衰減的發(fā)生，耐力運動可有效提高自噬水平而緩解骨骼肌衰減。Lira等[25]檢測C57BL/6小鼠自主運動1個月后趾肌自噬相關(guān)基因的表達時，發(fā)現(xiàn)自噬基因Beclin-1和LC3等增加，認為細胞自噬對骨骼肌維持收縮活動和發(fā)揮功能有重要作用。MacKenzie等[26]認為，抗阻訓練通過激活mVps34-Beclin-1復合物通路，上調(diào)細胞自噬水平來降解受損的細胞器和蛋白質(zhì)，能有效維持骨骼肌質(zhì)量。Masiero等[4]發(fā)現(xiàn)，在敲除小鼠自噬基因Atg7后，自噬的抑制并不會在分解代謝的條件下保持肌肉的質(zhì)量，且在去神經(jīng)的過程中會加劇肌肉的流失。上述研究表明，自噬的激活可以增加受損細胞器和蛋白質(zhì)的降解，為細胞再生提供一定的合成底物和能量，緩解肌肉的萎縮，維持肌肉的質(zhì)量、收縮活動和功能的發(fā)揮。然而，F(xiàn)eng等[27]研究發(fā)現(xiàn)，過度訓練可使肌肉萎縮相關(guān)基因MuRF1、Atrogin-1和自噬相關(guān)基因LC3、Atg7、Beclin-1、FoxO3表達增加，引起細胞自噬過度激活，過多降解骨骼肌細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和細胞器等主要成分，使肌肉發(fā)生萎縮，肌肉活動和功能下降。說明細胞自噬的過度激活，也會造成肌肉的萎縮，這對于肌肉萎縮的治療是一把“雙刃劍”，適當促進自噬以緩解肌肉萎縮非常重要。

本研究表明，模型組腓腸肌Beclin-1 mRNA表達在7 d、21 d和28 d高于假手術(shù)組，Vps34 mRNA表達在14 d、21 d和28 d高于假手術(shù)組，LC3 mRNA表達在21 d高于假手術(shù)組，提示大鼠失神經(jīng)后，隨時間延長，細胞自噬活性升高。推拿干預后，推拿組腓腸肌肌濕重比、截面積和直徑高于模型組，提示骨骼肌萎縮減輕，推拿治療有效且具有持續(xù)性。同時發(fā)現(xiàn)，在7 d、21 d和28 d中，推拿組腓腸肌Beclin-1、LC3 mRNA和Vps34 mRNA(除28 d)表達高于模型組，提示推拿干預后，細胞自噬活性增強，推拿治療可能是通過促進細胞自噬活性，減輕失神經(jīng)骨骼肌萎縮的程度。推拿組28 d時腓腸肌Beclin-1、Vps34和LC3 mRNA表達低于21 d，提示在28 d時，推拿治療促進自噬活性增強的作用在下降，但仍是促進自噬。本課題組前期研究表明，電針在失神經(jīng)8周時抑制自噬過度激活，延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮[7]。因此，推拿治療是否在后期會抑制自噬，以及推拿如何對自噬進行調(diào)控以減輕失神經(jīng)肌萎縮程度的具體機制，還需進一步研究。

綜上所述，推拿治療失神經(jīng)肌萎縮的機制可能是通過上調(diào)自噬相關(guān)因子Beclin-1、Vps34和LC3的mRNA表達，促進細胞自噬的激活，清除損傷細胞器和蛋白質(zhì)，為肌纖維再生提供一定的合成底物和能量，從而減輕失神經(jīng)骨骼肌萎縮的程度。