羅 斌,鄭 茜,王林琪,邰 燁,唐俊明,陳 晉
(湖北醫(yī)藥學(xué)院 1生理學(xué)教研室, 2藥護(hù)學(xué)院, 3口腔學(xué)院, 4公共衛(wèi)生與管理學(xué)院, 湖北 十堰 442000)
大量研究表明,心力衰竭(heart failure,HF)的發(fā)病及預(yù)后與心臟的自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān),是交感神經(jīng)系統(tǒng)過度活躍及副交感神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)異常低下所引起的綜合癥狀[1-3]。在HF患者體內(nèi),尿兒茶酚胺和血漿去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)水平明顯升高,交感神經(jīng)緊張性增強(qiáng)及心血管反射異常[1, 4-5]。NE主要是由交感節(jié)后神經(jīng)元合成和分泌的一種神經(jīng)遞質(zhì),其通常負(fù)責(zé)對機(jī)體受到應(yīng)激時(shí)作出反應(yīng)[3],在誘導(dǎo)心臟發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)中,NE會(huì)引起心肌肥大甚至心肌細(xì)胞凋亡[6]。
因此,改善自主神經(jīng)系統(tǒng)功能失衡成為缺血性心肌保護(hù)的一個(gè)重要研究方向。研究證實(shí),在心肌缺血發(fā)生前后的不同時(shí)點(diǎn)刺激迷走神經(jīng)以增加其末梢遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)的合成與釋放,均能夠產(chǎn)生有效的心肌保護(hù)作用[7-9]。目前,通過刺激迷走神經(jīng)治療HF的機(jī)制研究仍處于初級(jí)階段[10-11],因此,本實(shí)驗(yàn)建立NE誘導(dǎo)心肌 H9c2細(xì)胞凋亡的模型,觀察ACh對NE誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞凋亡的影響,研究ACh可能通過哪種信號(hào)分子發(fā)揮作用,為HF等心臟疾病提供新的治療靶點(diǎn)。
心肌H9c2細(xì)胞株由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所提供。磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)和胰蛋白酶(Gibico);阿托品、ACh、NE和MTT(Sigma);PI3K/AKT信號(hào)分子阻斷劑LY294002、 ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑 PD98059、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑SB203580和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)分子阻斷劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)均購自碧云天;Annexin-V-FLUOS 染色試劑盒和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(Roche);線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1染色;Life Technologies)。
2.1H9c2細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基,置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃的溫箱條件下培養(yǎng)。建立NE誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、ACh保護(hù)細(xì)胞模型及藥物干預(yù)時(shí),培養(yǎng)基改為2%胎牛血清培養(yǎng)。分別選取NE濃度為0、5、10和20 μmol/L,處理24 h,確定細(xì)胞凋亡損傷模型的最適NE濃度。
為了確定最適ACh濃度,將H9c2細(xì)胞分別用濃度為0、0.1、1和10 μmol/L 的ACh預(yù)處理1 h后,用 PBS 洗2遍,再添加NE 于培養(yǎng)基中作用24 h。其次,再次確定ACh是否有保護(hù)作用,實(shí)驗(yàn)分為6組:對照(control)組;NE(10 μmol/L)組;ACh(10 μmol/L)組;ACh+NE組;阿托品(100 μmol/L)+NE組;阿托品+ACh+NE組。阿托品于添加ACh前1 h加入。
為了研究ACh的作用機(jī)制,使用阻斷劑預(yù)處理1 h后再用ACh預(yù)處理1 h,之后添加NE于培養(yǎng)基作用 H9c2細(xì)胞作用24 h,將H9c2細(xì)胞分為8組:(1)對照組;(2)NE組;(3)ACh+NE組;(4)阿托品+ACh+NE組;(5)LY294002(10 μmol/L)+ACh+NE組;(6)PD98059(50 μmol/L)+ACh+NE組;(7)SB203508(30 μmol/L)+ACh+NE組;(8)PDTC(50 μmol/L)+ACh+NE組。
2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 將 H9c2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞生長至培養(yǎng)孔面積80%時(shí),用上述分組的不同因素處理后,加入MTT(5 g/L)置于培養(yǎng)箱孵育4 h,離心棄上清,加入二甲基亞砜,每孔200 μL,用酶標(biāo)儀檢測各組吸光度(A)值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞相對活力:細(xì)胞相對活力(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。
2.3JC-1染色測定線粒體膜電位 將H9c2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中,當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積約80%時(shí),按照上述各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素作用后,用 PBS 洗1次,加入0.2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液和0.2 mL JC-1染色工作液,充分混合后在37 ℃孵育20 min,然后吸除上清,用JC-1染色緩沖液洗滌2次,加入0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。在熒光倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)拍攝紅色與綠色熒光圖片,用Image-Pro Plus 6.0軟件分析5個(gè)視野紅色熒光強(qiáng)度平均值(red mean fluorescence intensity,RMFI)與綠色熒光強(qiáng)度平均值(green mean fluorescence intensity, GMFI)的比值,然后對每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS生成 將 H9c2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中,當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積約80%時(shí),按照上述各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素作用后,消化、收集細(xì)胞和上消化液,離心后棄上清液,PBS 洗1次,加入不含血清的EDTA及10 μmol/L的DCFH-DA,37 ℃孵育20 min(每3 min混勻1次,使探針和細(xì)胞充分接觸),離心棄上清,PBS 洗3次,再加入1 mL PBS重懸后用流式細(xì)胞術(shù)檢測,使用488 nm激發(fā)波長,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果以與對照組的熒光強(qiáng)度比例的百分率表示,圖中峰值右移,代表平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng),ROS相對含量增多。
2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將 H9c2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中,當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積約80%時(shí),按照上述各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素作用后,消化、收集細(xì)胞和上消化液,離心后棄上清液,PBS 洗1次,加入Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入Annexin V-FITC混勻后,加入PI混勻,室溫、避光、反應(yīng)10 min,用流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。激發(fā)光波長為488 nm,F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光,PI發(fā)紅色熒光。CellQuest 軟件分析結(jié)果,結(jié)果以凋亡細(xì)胞的百分率表示,即右上象限(晚凋)+右下象限(早凋)。
用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
選取濃度為0、5、10和20 μmol/L的NE處理H9c2細(xì)胞24 h,結(jié)果顯示,隨著NE干預(yù)濃度的增加(從10 μmol/L開始),細(xì)胞活力顯著降低,并低于50%,呈明顯的劑量依賴關(guān)系(P<0.05),見圖1A。因此,選擇10 μmol/L作為NE的損傷濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
選取濃度為0、0.1、1和10 μmol/L 的ACh預(yù)處理H9c2細(xì)胞1 h,后加入NE(10 μmol/L)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷,結(jié)果顯示,10 μmol/L的ACh作用最大,可使細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05),見圖1B。因此,選擇10 μmol/L作為ACh的最適濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
Figure 1.The viability of the H9c2 cells treated with NE and ACh at different doses was measured by MTT assay. A: the H9c2 cells were treated with different doses of NE for 24 h; B: the H9c2 cells were treated with different doses of ACh for 1 h and then 10 μmol/L NE for 24 h. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vsNE (10 μmol/L) group.
圖1MTT法實(shí)驗(yàn)檢測NE和ACh對心肌H9c2細(xì)胞活力的影響
線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件,紅色提示膜電位正常,綠色提示膜電位降低,通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變(RMFI與GMFI的比值降低)可以很容易地檢測到線粒體細(xì)胞膜電位的下降。與NE 組比較,ACh+NE組的線粒體細(xì)胞膜電位上升(P<0.05);與ACh+NE組比較,阿托品+ACh+NE組線粒體細(xì)胞膜電位下降(P<0.05)。若在ACh預(yù)處理之前,分別加入PI3K信號(hào)分子阻斷劑、ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑和NF-κB信號(hào)分子阻斷劑,與ACh+NE組比較,只有加入NF-κB信號(hào)分子阻斷劑組的線粒體膜電位明顯降低(P<0.05),其余3組與ACh+NE組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖2。
細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇可以氧化無熒光的DCFH而生成有熒光的DCF,流式圖中峰值右移代表ROS含量增多。與NE 組比較,ACh+NE組的ROS含量明顯下降(P<0.05);與ACh+NE組比較,阿托品+ACh+NE組的ROS含量增加(P<0.05)。若在ACh預(yù)處理之前,分別加入PI3K信號(hào)分子阻斷劑、ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑和NF-κB信號(hào)分子阻斷劑,與ACh+NE組比較,加入NF-κB信號(hào)分子阻斷劑組的ROS含量明顯增加(P<0.05),其余3組的ROS含量與ACh+NE組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖3。
Figure 2.JC-1 staining was used for determining the changes of mitochondrial membrane potential (×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsACh+NE group.
圖2激光共聚焦成像檢測心肌H9c2細(xì)胞的線粒體膜電位水平
Annexin V-FITC/PI染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測H9c2細(xì)胞的凋亡率。與NE 組比較,ACh+NE組的細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05);與ACh+NE組比較,阿托品+ACh+NE組的細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。若在ACh預(yù)處理之前,分別加入PI3K信號(hào)分子阻斷劑、ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑和NF-κB信號(hào)分子阻斷劑,與ACh+NE組比較,加入NF-κB信號(hào)分子阻斷劑組的細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05),其余3組的細(xì)胞凋亡率與ACh+NE組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖4。
Figure 3.DCFH staining analysis for ROS level in the H9c2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsACh+NE group.
圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌H9c2細(xì)胞內(nèi)的ROS水平
細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的主動(dòng)有序的細(xì)胞自我消亡過程,在心肌缺血、心肌梗死及心力衰竭等心血管疾病的病理過程中廣泛參與。若能阻止或減少凋亡,對于減輕由于細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的心臟功能的減退,在多種心血管疾病的治療中有著重要意義[12]。
大量研究表明,心力衰竭是交感神經(jīng)系統(tǒng)過度活躍及副交感神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)異常低下所引起的綜合癥狀[1-3]。在心力衰竭患者體內(nèi),尿兒茶酚胺和血漿去甲腎上腺素水平明顯升高。在誘導(dǎo)心臟發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)中,NE會(huì)引起心肌肥大甚至心肌細(xì)胞凋亡[6]。1998年 Communal等[13]應(yīng)用成年大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)模型,證實(shí)高濃度NE可引起心肌細(xì)胞凋亡。在心肌缺血發(fā)生前后的不同時(shí)點(diǎn)刺激迷走神經(jīng)以增加其末梢遞質(zhì)ACh的合成與釋放,均能夠產(chǎn)生有效的心肌保護(hù)作用[7-9]。本研究使用高濃度(10 μmol/L)的NE處理心肌 H9c2細(xì)胞,模擬HF發(fā)生發(fā)展過程中高兒茶酚胺類激素的微環(huán)境,觀察ACh(10 μmol/L)預(yù)處理對心肌細(xì)胞保護(hù)作用。與既往報(bào)道一致,高濃度NE可明顯損傷心肌 H9c2細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低、線粒體膜電位丟失、ROS生成增多及細(xì)胞凋亡率顯著增加;經(jīng)ACh預(yù)處理后,細(xì)胞存活率升高、ROS生成減少,也抑制了線粒體膜電位丟失及細(xì)胞凋亡。阿托品為經(jīng)典的競爭性M型膽堿受體阻斷劑,能阻斷ACh或膽堿受體激動(dòng)藥與受體結(jié)合,拮抗其對M受體的激動(dòng)效應(yīng)。我們觀察到,在加入阿托品(100 μmol/L)后,可顯著降低ACh對心肌H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用。
Figure 4.The cell apoptotic rate was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsACh+NE group.
圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌H9c2細(xì)胞的凋亡水平
雖然我們已經(jīng)知道上調(diào)迷走神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性或增加ACh的釋放,均能夠產(chǎn)生有效的心肌保護(hù)作用,但其具體機(jī)制仍然沒有完全研究清楚。李冬玲等[14]和吳濤等[15]認(rèn)為,迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)ACh是膽堿能抗炎和抗凋亡通路的重要組成成分,提高迷走張力或增加ACh的釋放可通過活化α7nAChR及其下游信號(hào)分子發(fā)揮對缺血心肌的保護(hù)作用。在細(xì)胞內(nèi), 多種信號(hào)分子可參與炎性因子與凋亡因子的表達(dá),如ROS、NF-κB、p38 MAPK及AKT等[14, 16]。
為了進(jìn)一步研究ACh發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制,在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,我們在ACh預(yù)處理時(shí),分別加入了與凋亡及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的4種信號(hào)通路分子阻斷劑: PI3K/AKT信號(hào)分子阻斷劑LY294002、 ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑PD98059、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑SB203580和NF-κB信號(hào)分子阻斷劑PDTC進(jìn)行干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有加入NF-κB阻斷劑后ACh的保護(hù)作用顯著減弱。
從以上結(jié)果我們推測,ACh可以抑制高濃度的NE誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是通過NF-κB信號(hào)分子介導(dǎo)的。此外,離體細(xì)胞模型與在體模型存在差異,因此,本課題組擬在心肌梗死動(dòng)物模型開展進(jìn)一步的研究。