常戈鋆， 陳利娟， 陳慧莉

腫瘤的發(fā)生是多種基因的突變積累和交叉作用[1]。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)GR5、Nanog及相關(guān)信號通路P13K、Wnt構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[2-3]。Nanog基因首次在囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團、原始生殖細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，后發(fā)現(xiàn)其與多種腫瘤相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)了普遍存在LGR5高度活化現(xiàn)象，二者均被認(rèn)為參與了細(xì)胞因子調(diào)節(jié)作用并產(chǎn)生腫瘤免疫應(yīng)答的抑制效應(yīng)[4-5]。但目前，關(guān)于Nanog、LGR5與惡性腫瘤的研究主要集中于宮頸癌[6]、胃癌[7]等，其與結(jié)腸腺癌的關(guān)系研究很少。本研究收集132例結(jié)腸腺癌患者為研究對象，分析Nanog、LGR5在結(jié)腸腺癌中表達及其臨床意義，以期為結(jié)腸腺癌的分子研究、預(yù)后判斷提供更多依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 臨床資料 收集2011年10月至2014年6月航空總醫(yī)院收治的行手術(shù)治療的結(jié)腸腺癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 病理學(xué)確診為結(jié)腸腺癌；② 首次確診；③ 患者均行手術(shù)治療，手術(shù)切除標(biāo)本保存于本院病理科或?qū)嶒炇摇Ｅ懦龢?biāo)準(zhǔn)：① 圍術(shù)期死亡；② 合并有其他惡性腫瘤；③ 臨床資料或隨訪信息不全。132例納入研究。其中，男70例，女62例；年齡38～88歲，中位年齡56歲。同時，收集同期60例結(jié)腸腺瘤患者臨床資料，男35例，女25例；年齡32～81歲，中位年齡52歲。72例因其他良性疾病(其中結(jié)腸慢運輸型便秘30例，乙狀結(jié)腸冗長癥20例，潰瘍性結(jié)腸病13例，脾曲綜合征9例)而行結(jié)腸切除的患者資料，男42例，女30例；年齡30～79歲，中位年齡54歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審查，患者知情同意?；颊咭话阗Y料相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有可比性。

1.2 主要試劑 LGR5多克隆抗體(Abcam公司，美國)，Nanog 多克隆抗體(Abcam公司，美國)，免疫組化SP試劑盒購(Zymed 公司，美國)，一抗工作液濃度為1∶100。DAB顯色試劑(武漢博士德生物工程有限公司)。RIPA裂解液、30%聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳上樣緩沖液(5xSDS)均購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化 檢測及結(jié)果判定組織均經(jīng)甲醛固定后，石蠟包埋，厚切片，厚度4 μm。對組織切片進行常規(guī)脫蠟、水化，H2O2去離子水孵育，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的干擾。EDTA 液高溫修復(fù)抗原，自然冷卻后PBS沖洗，滴加50 μl LGR5多克隆抗體、Nanog 多克隆抗體(濃度1∶100)，4 ℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次，每次2 min。滴加二抗，37 ℃孵育20～30 min。PBS沖洗3次，每次2 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用半定量積分法判斷陽性結(jié)果，以出現(xiàn)棕色顆粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 Western blotting檢測 制備12%分離膠、5%濃縮膠，配制SDS-PAGE緩沖液。調(diào)節(jié)電泳參數(shù)：濃縮膠80 V，0.5 h；分離膠120 V，1.5 h。從陽極到陰極，依次放置海綿、3M濾紙、PVDF膜、凝膠、3M濾紙、海綿。加入轉(zhuǎn)膜液，恒壓90 V，90 min，在室溫下，用封閉緩沖液封閉60 min。嚴(yán)格按照試劑盒說明進行免疫反應(yīng)。暗室中，在保鮮膜上等體積混合ECL試劑盒中試劑A和試劑B，將混合液與朝下膜蛋白面充分接觸1 min后，將PVDF膜移至另一保鮮膜，移去殘液。轉(zhuǎn)移至凝膠成像系統(tǒng)機中進行曝光，以β-tubline為內(nèi)參，進行圖像分析，采用Image J軟件對條帶灰度值的比值進行對比分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用率(%)描述，組間比較采用χ2檢驗；多因素分析采用Logistic風(fēng)險模型進行；生存曲線采用Kaplan-Meier法統(tǒng)計，Log-rank 檢驗比較生存曲線的差異。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 結(jié)腸腺癌、腺瘤及正常組織中LGR5、Nanog的表達

分組LGR5陽性陰性χ2值P值Nanog陽性陰性χ2值P值正常組織(n=72)12601.958a0.162a14583.301a0.069a結(jié)腸腺瘤(n=60)164422.591b<0.001b204024.537b<0.001b結(jié)腸腺癌(n=132)844841.255c<0.001c943850.114c<0.001c

注：a：結(jié)腸正常組織與結(jié)腸腺瘤組織相比；b：結(jié)腸腺癌組織與結(jié)腸腺瘤組織相比；c：結(jié)腸腺癌組織與結(jié)腸正常組織相比

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測LGR5、Nanog在腺瘤組織、結(jié)腸腺癌組織中表達 LGR5主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞膜也有少量表達。LGR5在正常組織、腺瘤組織中不表達，在結(jié)腸腺癌組織中陰性、陽性表達均有，見圖1；Nanog則主要定位于細(xì)胞核，Nanog在正常組織、腺瘤組織中不表達，在結(jié)腸腺癌組織中陰性、陽性表達均有，見圖2。LGR5在正常組織、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺癌組織中的陽性率分別為16.7%(12/72)、26.7%(16/60)、63.6%(84/132)。Nanog的陽性率分別為19.4%(14/72)、33.3%(20/60)、71.2%(94/132)。LGR5、Nanog在腺癌組織中的陽性率高于腺瘤及正常組織，但腺瘤與正常組織之間的陽性率無明顯差異(P>0.05)。見表1。

圖1 LGR5在結(jié)腸腺癌組織中的表達1A：LGR5在結(jié)腸腺癌組織中陰性表達(×100)；1B：LGR5在結(jié)腸腺癌組織中陽性表達(×100)；1C：LGR5在結(jié)腸腺癌組織中陽性表達(×400)

圖2 Nanog在結(jié)腸腺癌組織中的表達2A：Nanog在結(jié)腸腺癌組織中陰性表達(×100)；2B：Nanog在結(jié)腸腺癌組織中陽性表達(×100)；2C：Nanog在結(jié)腸腺癌組織中陽性表達(×400)

2.2 Western-blot檢測結(jié)果 Western Blot檢測結(jié)果顯示， LGR5、Nanog在正常組織和結(jié)腸腺瘤組織中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LGR5、Nanog在結(jié)腸腺癌組織中表達高于正常組織、結(jié)腸腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖3。

圖3 Western-blot檢測LGR5、Nanog表達結(jié)果

2.3 LGR5表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 單因素方差分析顯示：結(jié)腸腺癌患者Dukes分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是LGR5表達的影響因素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。多因素方差分析顯示：結(jié)腸腺癌患者Dukes分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者LGR5陽性表達的獨立危險因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度越低、Dukes分期越晚，LGR5的陽性率越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 LGR5表達與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

臨床參數(shù)例數(shù)(n)LGR5陽性(n=84)陰性(n=48)χ2值P值年齡(歲)0.3630.547 ≤605436(66.67)18(33.33) >607848(61.54)30(38.45)性別1.5690.21 男7048(68.57)22(31.43) 女6236(58.06)26(54.17)Dukes分期31.392<0.001 A+B6224(38.71)38(61.29) C+D7060(85.71)10(14.29)分化程度12.576<0.001 中-高7840(51.28)38(48.72) 低5444(81.48)10(18.52)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11.3190.001 有9250(54.35)42(45.65) 無4034(85.00)6(15.00)

2.4 Nanog表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 單因素方差分析顯示：結(jié)腸腺癌患者Dukes分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是Nanog表達的影響因素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。多因素方差分析顯示：結(jié)腸腺癌患者Dukes分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者LGR5陽性表達的獨立危險因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度越低、Dukes分期越晚，Nanog的陽性率越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表3 LGR5表達與臨床病理參數(shù)關(guān)系的多因素分析

病理參數(shù)β值SE值Wald值OR值95%CIP值Dukes分期0.4540.1865.9701.5751.094～2.2670.015分化程度-0.6960.19612.5911.6691.185～2.3510.015淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.5840.1899.5121.7931.237～2.6000.002

表5 LGR5表達與臨床病理參數(shù)關(guān)系的多因素分析

病理參數(shù)β值SE值Wald值OR值95%CIP值Dukes分期0.0320.00723.1521.0331.019～1.047<0.001分化程度0.5420.1769.5381.7201.219～2.4260.037淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.0050.0096.5681.0241.214～1.6330.008

2.5 生存率 隨訪截至2018年5月，132例結(jié)腸腺癌患者失訪27例，成功隨訪105例，有效隨訪率為79.5%，中位隨訪時間56個月。LGR5(+)與LGR5(-)患者的中位生存時間分別為9.5個月、17.8個月，Nanog(+)與Nanog(-)患者的中位生存時間分別為7.8個月、16.6個月。Log-rank檢驗示，LGR5(-)組患者生存率高于LGR5(+)組(χ2=4.603，P=0.031)，Nanog(-)組患者生存率高于Nanog(+)組(χ2=13.870，P<0. 001)。見圖4。

表4 Nanog表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

臨床參數(shù)例數(shù)(n)LGR5陽性(n=94)陰性(n=38)χ2值P值年齡(歲)0.0450.831 ≤605439(54.35)15(45.65) >607855(85.00)23(15.00)性別2.1970.138 男7046(65.71)24(34.29) 女6248(77.42)14(22.58)Dukes分期9.8580.002 A+B6236(58.06)26(41.94) C+D7058(82.86)12(17.14)分化程度13.929<0.001 中-高7846(58.97)32(41.03) 低5448(88.89)6(11.11)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15.841<0.001 有9256(60.87)36(39.13) 無4038(95.00)2(5.00)

3 討論

圖4 結(jié)腸腺癌患者的5年生存率曲線4A：LGR5(-)組與LGR5(+)組患者患者5年生存率曲線；4B：Nanog(-)與Nanog(+)組患者患者5年生存率曲線

在我國，隨著人們生活習(xí)慣、食譜的變化，結(jié)腸腺癌發(fā)病率呈明顯的上升趨勢，每年新發(fā)病例40萬[8]。結(jié)腸腺癌早期缺乏特異性癥狀或體征，很多患者在首次確診時就處于中晚期，失去了最佳手術(shù)時機。如能在分子或基因?qū)用?，找到關(guān)鍵部位的基因、蛋白或其他環(huán)節(jié)，了解結(jié)腸腺癌發(fā)生發(fā)展機制，則有望確定新的診斷及治療方法，為結(jié)腸腺癌早發(fā)現(xiàn)、有效治療提供依據(jù)。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為惡性腫瘤中存在一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，具有多向分化、自我復(fù)制、更新能力強等特點，可長期有效維持腫瘤生長與衰退的動態(tài)平衡[9]。LGR5、 Nanog是胚胎干細(xì)胞中表達的轉(zhuǎn)錄因子，參與了ESCs的自我更新和多向分化，二者被認(rèn)為可能處于干細(xì)胞全能性調(diào)控機制的頂端，對下游基因介導(dǎo)的分化、更新能力密切相關(guān)[10]。Azhdarinia等[11]發(fā)現(xiàn)LGR5的高表達與腫瘤血管生成相關(guān)；Nanog則能與層黏蛋白等組織纖維結(jié)合，參與細(xì)胞與細(xì)胞間非特異性粘連。Tang等[12]發(fā)現(xiàn)LGR5、 Nanog在前列腺癌、精原細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤中的表達均上升。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸腺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期是影響患者LGR5、Nanog陽性表達的獨立性危險因素。LGR5、 Nanog表達陽性的腫瘤細(xì)胞有著更高的生長活性，使結(jié)腸腺癌分化更差、更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時，LGR5、Nanog在結(jié)腸腺癌組織中的表達高于正常結(jié)腸組織、結(jié)腸腺瘤組織(P<0.05)，提示結(jié)腸腺癌生物學(xué)行為的優(yōu)劣與LGR5、Nanog蛋白的表達水平呈負(fù)相關(guān)，即LGR5、Nanog蛋白表達水平越高，細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化可能性就越大。

目前，手術(shù)、化療、放療等綜合治療手段可明顯減輕結(jié)腸腺癌患者腫瘤負(fù)荷，但并未能十分有效地防止腫瘤復(fù)發(fā)，患者的總體生存率仍不夠高。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤組織中存在數(shù)量極少的腫瘤干細(xì)胞，且多處于靜止期，常規(guī)化療藥物無法有效殺滅，這就部分解釋了許多患者在術(shù)后及化療后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。結(jié)腸干細(xì)胞一般位于結(jié)腸黏膜的隱窩基底部，可起源于正常結(jié)腸干細(xì)胞，也可起源于已分化成熟的結(jié)腸細(xì)胞，并通過轉(zhuǎn)化獲得自我更新能力，其表面常存在三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體的異常高表達，被認(rèn)為是結(jié)腸腺癌患者出現(xiàn)化療效果不佳甚至化療抵抗的根源。本研究132例結(jié)腸腺癌患者中，免疫組化結(jié)果顯示LGR5、Nanog在癌組織中的陽性率均顯著高于癌旁組織，Western-blot實驗也得出了相同結(jié)論。此外，我們通過隨訪發(fā)現(xiàn)，LGR5(+)與LGR5(-)患者的中位生存時間分別為9.5個月、17.8個月，Nanog(+)與Nanog(-)患者的中位生存時間分別為7.8個月、16.6個月，LGR5(-)組患者生存率高于LGR5(+)組(P<0.05)，Nanog(-)組患者生存率高于Nanog(+)組(P<0.05)。這可能與正常結(jié)腸細(xì)胞發(fā)生癌變后，腫瘤干細(xì)胞大量增殖，腫瘤組織中LGR5、Nanog表達上調(diào)，繼而促進腫瘤分期提高、分化程度變差、淋巴轉(zhuǎn)移增加。

綜上所述， LGR5、Nanog可作為判斷患者預(yù)后的潛在因子，未來可針對結(jié)腸腺癌中高表達LGR5、Nanog等具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞進行靶向治療，提高療效、降低復(fù)發(fā)率。但本研究樣本量尚小，且為單中心研究，未來在更大樣本量，更長隨訪時間的基礎(chǔ)上進行多中心研究，或能得到更有價值的臨床結(jié)論。