酸性伊紅粉劑的制備及在HE染色中的應用

李杏娟

（南京明基醫(yī)院病理科 江蘇 南京 210019）

伊紅又名曙紅，為磚紅色粉末狀或醬紅色結晶，是病理學實驗室中HE染色最常用的胞漿染料。曙紅本身溶于醇而不溶于水，也稱醇溶性伊紅，而它的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽可溶于水，因此稱為水溶性伊紅。在常規(guī)工作中伊紅染料雖然配方較多，但是在操作及染色效果方面不夠理想，常需加入冰醋酸，但加入劑量不易掌握，量少達不到促染作用，加入過多染液易沉淀，且引起色調不正，特別是容易褪色，染色結果不能長期保存。為了更好的增強染色效果和提高工作效率，筆者用了一整瓶（25g）醇溶性伊紅Y和10ml鹽酸等，一次性配制成酸性伊紅粉劑貯存。此粉劑性質穩(wěn)定，后續(xù)使用時簡便易操作，所配制的伊紅染液著色力強且持久，所染切片顏色亮麗、不易褪色，后期易長期保存?，F(xiàn)將酸化伊紅粉劑的制備方法及應用體會介紹如下：

1.資料與方法

A：醇溶性伊紅Y 25g（圖1），蒸餾水500ml，鹽酸10ml。60℃溫箱，1000毫升三角燒瓶或燒杯一個，漏斗一個，玻璃棒一根，大號濾紙一張。

圖 1 醇溶性伊紅 Y 25g

圖 2 蒸餾水 500ml+ 醇溶性伊紅Y25g，攪拌溶解。

圖 3 伊紅溶解后 + 鹽酸 10ml，靜置過夜。

圖 4 過濾。

圖 5 多次洗滌，再過濾。

B：在1000毫升三角燒瓶或燒杯中依次加入醇溶性伊紅Y 25g和蒸餾水500ml，攪拌溶解（圖2）；再加入鹽酸10ml，繼續(xù)充分攪拌溶解，之后靜置過夜（圖3）。次日用大號濾紙過濾，留濾紙上的沉淀，棄濾液（圖4）。用蒸餾水洗滌濾紙上的沉淀，過濾3到4次，棄濾液（圖5）。然后將沉淀物連同濾紙一起放入60℃烤箱內烘干。最后將干燥的伊紅粉末放置瓶中保存，此即為酸化伊紅粉劑。

C：使用時取其粉末0.5g，加95%乙醇500ml溶解即可。

2.結果

染色時間10～20秒，伊紅所染細胞及組織顏色亮麗，呈現(xiàn)出不同程度的紅色或粉紅色，與蘇木素所染的藍色細胞核對比明顯、清晰、層次分明。

3.分析討論

細胞質內構成蛋白質的氨基酸種類很多，他們有不同的酸堿度。當胞質的PH值調到它的等定點范圍，即PH4.7～5.0時，胞質呈現(xiàn)兼性離子（以蛋白質為主），對外不顯電性，此時酸性染料和堿性染料都很難使胞質染色，而調節(jié)其酸堿度可影響染色反應。在染液中加入一定量的鹽酸后把PH值調到了胞質等電點以下，即PH值小于4.7，這樣抑制了胞質的酸式電離，呈現(xiàn)出堿式電離，使胞質帶正電荷，易被帶負電荷（陰離子）的酸性染料染色。

伊紅Y（四溴熒光素二鈉鹽，分子式C20-H6O5Br4NO2）。一方面，其中的羥基（-OH）和羧基（-COOH）為酸性助色團，與堿作用生成鹽，其水溶液電離后生成的有色離子為陰離子，易與帶正電荷（陽離子）的氨基結合使胞質著色。胞質中的蛋白質如紅細胞中的血紅蛋白、嗜酸性粒細胞顆粒、肌肉和結締組織等被染成不同程度的紅色或粉紅色（圖6-10）。另一方面，室溫下，伊紅Y在水中的溶解度遠遠大于在酒精中的溶解度，它在溶液反應中，由于鈉離子的存在而成堿性狀態(tài)。而加入鹽酸后，即伊紅在酸化處理過程中，去除了染料中對染色有影響的金屬鈉離子和雜質，起到了促染的作用，這樣增加了染液與組織之間的親和力，從而增強了染液的染色能力，使染液具有著色快，分化不易褪色，顏色亮麗，與蘇木素所染的藍色細胞核對比突出。

圖 6 （HE×100）

圖 7 （HE×100）

圖 8 （HE×100）

圖 9 （HE×100）

圖 10 （HE×100）

4.小結

在病理技術常規(guī)HE染色中，以往用伊紅染液染色時，不僅染色時間長，而且在后續(xù)脫水過程中易褪色，使胞漿著色不理想，后續(xù)切片不利于保存。而預先配制好的酸性伊紅粉劑，性質穩(wěn)定，可長期保存而不影響試劑質量，隨時可以稱取配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，配制方法簡便易操作，染液著色力強且持久，在縮短染色時間的同時，之后的水洗和酒精脫水也不易褪色，且組織著色鮮艷，細胞漿、肌肉、纖維及紅細胞等色彩分明。既達到了染色目的，又使染色效果更好，染色后的切片也能長期保存而不褪色。在常規(guī)HE染色實踐中，1g酸化伊紅粉劑配制的染液可染HE切片約3000張，與其他伊紅染液相比，不僅操作簡單、提高染色質量、節(jié)省開支，而且縮短染色時間、省時省力。提高染色質量的同時，也提高了工作效率。