劉彩玉 楊麗亞

[摘要]目的：研究蘿卜硫素對中波紫外線（UVB）照射后黑素細胞產(chǎn)生黑素能力的抑制效應(yīng)及其對Traf6/TAK1信號傳導的影響。方法：采用人表皮黑素PIG1細胞為研究模型，分為對照組（Control）、模型組（Model，UVB照射）、蘿卜硫素處理組（10、20、40μM）。CCK8法分析PIG1細胞增殖情況，氫氧化鈉裂解法分析黑素含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分析優(yōu)黑素含量，Western blot技術(shù)檢測小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1（TRP-1）、TRP-2、腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6（Traf6）及轉(zhuǎn)錄生長因子β-活化激酶1（TAK1）表達。結(jié)果：與對照組比較，UVB照射能誘導PIG1細胞黑素及優(yōu)黑素含量顯著升高（P<0.05），還能促使MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6及p-TAK1蛋白表達水平顯著增高（P<0.05）;與模型組比較，不同濃度蘿卜硫素能降低PIG1細胞黑素及優(yōu)黑素的生成（P<0.05），還能顯著抑制MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6及p-TAK1蛋白表達（P<0.05），呈現(xiàn)出劑量依賴性。結(jié)論：蘿卜硫素通過抑制Traf6/TAK1信號傳導降低UVB誘導PIG1細胞黑素生成。

[關(guān)鍵詞]蘿卜硫素;人表皮黑素細胞;黑素;信號通路;腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6;轉(zhuǎn)錄生長因子β-活化激酶1

[中圖分類號]R329.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）03-0096-04

Abstract： Objective? To study the suppressed effects of sulforaphane on ultraviolet radiation B（ UVB）-stimulated melanogenesis of melanocytes（PIG1）， and observe its effect on Traf6/TAK1 signal pathway. Methods? PIG1 cells were cultured in vitro and divided into control group， UVB group（Model group）， sulforaphane intervention groups（10，20 and 40μM）. The cell proliferation was determined by CKK8 assay. Melanin and eumelanin were detected by NaOH splitting and ELISA assay， respectively. The expression levels of microphthalmia-associated transcription factor（MITF）， tyrosinase（TYR）， tyrosinase-related protein-1（TRP-1）， TRP-2， tumor necrosis factor associated receptor factor 6（Traf6）， transforming growth factor-β activated kinase-1（TAK1） were measured by Western blot. Results? Compared with control group， the contents of melanin and eumelanin were significantly increased（P<0.05）; the expression levels of MITF， TYR， TRP-1， TRP-2， Traf6 and p-TAK1 in PIG1 cells were also significantly increased（P<0.05）. Compared with model group， the expression levels of MITF， TYR， TRP-1， TRP-2， Traf6 and p-TAK1 were significantly suppressed， and production of melanin and eumelanin reduced in a dose dependent manner in each sulforaphane intervention group（P<0.05）. Conclusion? Sulforaphane inhibits melanin and eumelanin production through down-regulating Traf6/TAK1 signal pathway in UVB-irradiated melanocytes.

Key words： sulforaphane; melanocytes; melanin; pathway; Traf6; TAK1

蘿卜硫素（Sulforaphane）又稱“萊菔子素”，屬于異硫代氰酸鹽衍生物，廣泛分布于西蘭花、花椰菜、甘藍、蘿卜及芥菜等十字花科植物。對蘿卜硫素藥理學研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥及參與免疫調(diào)節(jié)等功效[1-4]。同時研究也發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素具有防治皮膚癌的作用，還有很強的光防護作用，主要包括預(yù)防皮膚炎癥、紅斑、皮膚上皮細胞氧化應(yīng)激損傷，光老化及皮膚腫瘤等[5]。人的皮膚長期在紫外線下照射會引起色素沉積，適量的皮膚色素沉著對機體健康非常關(guān)鍵[6]，能夠防止皮膚細胞遭受紫外線輻射引起的損傷[7]。然而過多的色素沉積會引起色斑、雀斑等癥狀[8]。其中黑素的產(chǎn)生需要酪氨酸酶參與，紫外線照射會誘導酪氨酸酶表達增高[9]，進而誘導黑素生成，因此降低酪氨酸酶的表達能夠抑制黑素的產(chǎn)生。然而，蘿卜硫素對皮膚黑素細胞產(chǎn)生黑素能力的影響報道甚少。因此，本文研究蘿卜硫素對人表皮黑素PIG1細胞產(chǎn)生黑素及優(yōu)黑素的影響，并探討蘿卜硫素對Traf6/TAK1信號通路的影響。

1? 材料和方法

1.1 主要材料：原代正常人皮膚黑素細胞PIG1（來源于上海ATCC細胞庫）;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）;CCK8試劑盒（Solarbio公司）;RIPA裂解液（杭州四季青公司）;BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀）;兔抗鼠MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6、TAK1、p-TAK1及β-actin抗體（Abcam公司）;羊抗兔IgG二抗（上海谷歌生物公司）;ELC化學發(fā)光檢測試劑盒（Advansta）;優(yōu)黑素試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器：BIORAD-550型酶標儀（美國伯樂公司）;BBS-V800型單人超凈臺（山東鑫貝西公司）;SPX-250型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）;GE-100型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）;Amersham Imager 600儀器（BIO-RAD，美國）。

1.3 PIG1細胞培養(yǎng)：采用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（不含抗生素）對PIG1細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為5% CO2、37℃恒溫。

1.4 UVB照射及蘿卜硫素處理：把對數(shù)生長期的PIG1細胞接種至6孔板，每孔3×105個細胞，分為對照組（Control）、模型組（Model，UVB照射）、蘿卜硫素處理組（10、20、40μM）。待細胞生長24h后，模型組和蘿卜硫素處理組細胞接受285～320nm波長的UVB照射（30mJ/cm2），照射結(jié)束后更換含不同濃度蘿卜硫素的新鮮培養(yǎng)液。連續(xù)UVB照射3d，末次照射后24h進行檢測。

1.5 CCK8實驗：對數(shù)生長期的PIG1細胞接種至96孔板，每孔1×105個細胞，培養(yǎng)過夜后，加入不同濃度蘿卜硫素（0、1、5、10、20、40、60、80、100μM）處理細胞24h。除去舊培養(yǎng)液，每孔加入20μl CCK8試劑，放于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，置于450nm波長的酶標儀中檢測細胞吸光度A值，并計算細胞相對存活率（%）=A實驗組/A對照組×100%。

1.6 黑素檢測：對數(shù)生長期的PIG1細胞接種至6孔板，每孔3×105個細胞，培養(yǎng)24h后，按照“1.4”中的方法處理細胞，UVB照射及蘿卜硫素干預(yù)完成后，收集細胞，加入200μl含10% DMSO的NaOH（1mol/L）溶液，水?。?0℃，1h），置于405nm波長的酶標儀中檢測各孔細胞吸光度A值。

1.7 優(yōu)黑素檢測：對數(shù)生長期的PIG1細胞接種至6孔板，每孔3×105個細胞，培養(yǎng)24h后，按照“1.4”中的方法處理細胞，UVB照射及蘿卜硫素干預(yù)完成后，收集細胞加入裂解液，BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)節(jié)每個樣品蛋白濃度一致后，采用ELISA試劑盒檢測優(yōu)黑素含量。

1.8 Western blot實驗：收集“1.7”中細胞裂解液，BCA法測定總蛋白濃度后，每孔上樣50μg進行凝膠電泳（恒壓70V，3h），待蛋白完全分離后進行蛋白轉(zhuǎn)膜實驗（恒流275mA，70min），5%脫脂牛奶封閉蛋白條帶1h后，孵育一抗（MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6、TAK1、p-TAK1及β-actin，稀釋比1‥1 000）4℃過夜，TBST洗膜3次，室溫孵育二抗（稀釋比1‥3 000）90min，TBST洗膜3次，ECL顯色，黑室曝光。蛋白條帶灰度值采用Image J軟件進行分析。

1.9 統(tǒng)計分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

2? 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素對PIG1細胞增殖的影響：0μM處理組用含1.2‰ DMSO培養(yǎng)液干預(yù)細胞，結(jié)果提示與對照組相比未發(fā)生明顯變化，說明培養(yǎng)液中1.2‰含量的DMSO對PIG1細胞增殖沒有影響。蘿卜硫素濃度小于60μM時，細胞相對存活率沒有發(fā)生顯著變化，但濃度高于60μM時，隨著蘿卜硫素劑量的升高細胞存活率顯著降低，當蘿卜硫素劑量為60、80、100μM時細胞存活率分別降低（12.3±3.1）%、（18.6±3.9）%、（25.1±4.3）%。因此，后續(xù)實驗選擇低（10μM）、中（20μM）、高（40μM）3種劑量蘿卜硫素。不同劑量蘿卜硫素對PIG1細胞相對存活率影響見圖1。

2.2 蘿卜硫素對PIG1細胞黑素生成的影響：與對照組（Control）相比，模型組（Model）中PIG1細胞黑素生成量顯著增高（P<0.05）;低、中、高濃度蘿卜硫素組中黑素含量相對于模型組分別降低（10.6±3.7）%、（20.0±3.8）%、（29.6±5.1）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。蘿卜硫素對PIG1細胞黑素生成的抑制作用見圖2。

2.3 蘿卜硫素對PIG1細胞優(yōu)黑素生成的影響：與對照組（Control）相比，模型組（Model）中PIG1細胞優(yōu)黑素生成量顯著增高（P<0.05）;低、中、高濃度蘿卜硫素組中優(yōu)黑素含量相對于模型組分別降低（22.2±4.2）%、（37.0±4.9）%、（48.1±5.6）%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。蘿卜硫素對PIG1細胞優(yōu)黑素產(chǎn)生的抑制作用見圖3。

2.4 蘿卜硫素對PIG1細胞中TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表達的影響：模型組細胞中TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表達相對于對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量蘿卜硫素組細胞中TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表達均顯著降低，差異比較有顯著性（P<0.05）。研究還發(fā)現(xiàn)TYR、TRP-1、TRP-2及MITF蛋白表達隨蘿卜硫素濃度增高而降低，表現(xiàn)出劑量依賴性，各藥物組比較差異有顯著性（F=13.068，P<0.05）。各組間TYR、TRP1、TRP2及MITF蛋白表達水平見圖4，表1。

2.5 蘿卜硫素對PIG1細胞中Traf6/TAK1信號通路的影響：模型組細胞中Traf6、p-TAK1蛋白表達相對于對照組明顯增高，差異比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量蘿卜硫素組細胞中Traf6、p-TAK1蛋白表達均顯著降低，差異有顯著性（P<0.05）。研究還發(fā)現(xiàn)Traf6、p-TAK1蛋白表達隨蘿卜硫素濃度增高而降低，表現(xiàn)出劑量依賴性，各藥物組比較差異有顯著性（F=12.507，P<0.05）;而TAK1蛋白在各組細胞中表達無明顯變化。各組間Traf6、TAK1、p-TAK1蛋白表達水平見圖5，表2。

3? 討論

人皮膚組織含有兩種類型黑素，即優(yōu)黑素及褐黑素[10]。優(yōu)黑素發(fā)揮的生物學作用相對褐黑素稍強，前者可以防止UVB照射降解黑素細胞。黑素沉積時優(yōu)黑素水平增高，褐黑素水平降低，而且優(yōu)黑素還能向褐黑素轉(zhuǎn)化[11]，進而降低黑素含量。研究報道MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白均與黑素產(chǎn)生有直接關(guān)系[12]，酪氨酸酶相關(guān)的酶不僅誘導黑素產(chǎn)生導致皮膚色素沉積，而且介導了哺乳動物皮膚色素沉積紊亂[13]。因此，抑制黑素產(chǎn)生相關(guān)蛋白的活性是阻止色素沉積的重要途徑。黑素沉積的發(fā)病機制復(fù)雜，具有頑固性和復(fù)發(fā)性的特點，研究發(fā)現(xiàn)紫外線日曬在其發(fā)病機制中起著重要作用[14]。

本實驗考察了蘿卜硫素處理紫外線照射的PIG1細胞后，分析了細胞中黑素含量及MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表達水平的變化。結(jié)果提示，UVB照射后PIG1細胞黑素水平明顯增高;而蘿卜硫素能呈濃度依賴性抑制UVB照射誘導的黑素產(chǎn)生。Western blot結(jié)果說明UVB照射可誘導PIG1細胞中MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表達量的增高，而蘿卜硫素處理后可以呈濃度依賴性地抑制相關(guān)蛋白的表達。提示蘿卜硫素可通過抑制酪氨酸酶相關(guān)蛋白表達進而降低PIG1細胞中黑素的產(chǎn)生。

腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6（Traf6）廣泛分布于多種組織中，可介導細胞內(nèi)多種生物學信號傳導[15]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)黑素細胞在非活躍狀態(tài)下能夠低表達Traf6，而在黑素瘤細胞中呈高表達狀態(tài)[16]，并且在UVB照射等刺激下能夠誘導Traf6表達上調(diào)[17-18]。亦有研究提示，蘿卜硫素能通過抑制Traf6信號傳導降低豬肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)[19]。早期研究已提出Traf6信號活化能夠誘導轉(zhuǎn)錄生長因子β-活化激酶1（TAK1）磷酸化，進而發(fā)揮多種生物學作用，包括調(diào)節(jié)增殖、黏附、分化，和生存等細胞過程[20]。已有研究表明TAK1磷酸化后能與MITF發(fā)生相互作用，誘導MITF表達[21]。但是，本文缺乏相關(guān)研究來證實蘿卜硫素誘導MITF表達下調(diào)是由于Traf6/TAK1信號傳導的抑制，無法得出Traf6/TAK1信號通路與MITF的上下游關(guān)系。因此，后期將會采用Traf6/TAK1信號通路抑制劑或激動劑干預(yù)黑素細胞，來探討蘿卜硫素是否通過調(diào)控Traf6/TAK1信號通路介導MITF表達，進而改變黑素的產(chǎn)生。

上述研究結(jié)果顯示，調(diào)節(jié)Traf6/TAK1信號通路很可能是蘿卜硫素影響黑素細胞黑素產(chǎn)生的重要機制。實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，UVB照射可誘導PIG1細胞中Traf6和p-TAK1蛋白的表達，而蘿卜硫素處理后可以呈濃度依賴性地抑制Traf6和p-TAK1蛋白的表達。提示蘿卜硫素可通過抑制Traf6/TAK1信號通路活化進而降低PIG1細胞中黑素的產(chǎn)生。

總之，蘿卜硫素抑制UVB照射誘導的黑素生成的藥理作用，可能與其通過抑制Traf6/TAK1信號傳導，進而降低MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表達有關(guān)。該實驗結(jié)果有助于加深對藥物治療機制的理解，為皮膚黑素沉積疾病的臨床治療提供理論參考。然而黑素產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程，在蘿卜硫素降低黑素產(chǎn)生的過程中，是否還有其他信號通路的參與還需進一步研究。

[參考文獻]

[1]Tortorella SM，Royce SG，Licciardi PV，et al.Dietary sulforaphane in cancer chemoprevention：the role of epigenetic regulation and HDAC inhibition[J].Antioxid Redox Signal，2015，22（16）：1382-1424.

[2]Nallasamy P，Si H，Babu PV，et al.Sulforaphane reduces vascular inflammation in mice and prevents TNF-α-induced monocyte adhesion to primary endothelial cells through interfering with the NF-κB pathway[J].J Nutr Biochem，2014，25（8）：824-833.

[3]Li B，Kim DS，Yadav RK，et al.Sulforaphane prevents doxorubicin-induced oxidative stress and cell death in rat H9c2 cells[J].Int J Mol Med，2015，36（1）：53-64.

[4]Park JH，Kim JW，et al.Sulforaphane inhibits the Th2 immune response in ovalbumin-induced asthma[J].BMB Rep，2012，45（5）：311-316.

[5]黃靜紅，李德如.蘿卜硫素的皮膚光保護作用研究進展[J].中國美容醫(yī)學，2008，17（11）：1698-1699.

[6]Ismaylov RG.Regulation of melanogenesis in the dyschromia of skin[J].Vestn Ross Akad Med Nauk，2014，（1-2）：85-92.

[7]Wang N，Hebert DN.Tyrosinase maturation through the mammalian secretory pathway：bringing color to life[J].Pigment Cell Res，2006，19（1）：3-18.

[8]訾紹霞，劉愛英，張?zhí)m娟，等.紫草素抑制紫外線輻射后黑素合成的研究[J].中國美容醫(yī)學，2017，26（1）：88-90.

[9]安彩霞，趙亞楠，王紅娟，等.氨甲環(huán)酸對中波紫外線照射后黑素細胞影響的研究[J].中國美容醫(yī)學，2014，23（20）：1708-1710.

[10]杜站宇，趙家平，宋興超，等.黑素小體在黑色素生成過程中的關(guān)鍵作用[J].畜牧獸醫(yī)學報，2016，47（8）：1531-1538.

[11]李艷，艾儒棣，肖樺.祛斑湯對小鼠皮膚優(yōu)黑素及褐黑素合成的影響[J].時珍國醫(yī)藥，2013，24（1）：146-147.

[12]Pillaiyar T，Manickam M，Jung SH.Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis[J].Cellular Signal，2017，40（3）：99-115.

[13]Olivares C，Solano F.New insights into the active site structure and catalytic mechanism of tyrosinase and its related proteins[J].Pigment Cell Melanoma Res，2009，22（6）：750-760.

[14]Falabella R，Barona MI.Update on skin repigmentation therapies in vitiligo[J].Pigment Cell Melanoma Res，2009，22（1）：42-65.

[15]Schimmack G，Schorpp K，Kutzner K，et al.YOD1/TRAF6 association balances p62-dependent IL-1 signaling to NF-κB[J].Elife，2017，6（11）：126-133.

[16]Luo Z，Zhang X，Zeng W，et al.TRAF6 regulates melanoma invasion and metastasis through ubiquitination of Basigin[J].Oncotarget，2016，7（6）：7179-7192.

[17]Zhou P，Hao Z，Wang X，et al.UV irradiation triggers cylindromatosis translocation， modification， and degradation in a proteasome-independent manner[J].DNA Cell Biol，2016，35（3）：140-145.

[18]Min W，Ahmad I，Chang ME，et al.Baicalin protects keratinocytes from Toll-like receptor-4 mediated DNA damage and inflammation following ultraviolet irradiation[J].Photochem Photobiol，2015，91（6）：1435-1443.

[19]Yang Q，Pr?ll MJ，Salilew-Wondim D，et al.LPS-induced expression of CD14 in the TRIF pathway is epigenetically regulated by sulforaphane in porcine pulmonary alveolar macrophages[J].Biochem J，2016，22（8）：682-695.

[20]Zhang J，Macartney T，Peggie M，et al.Interleukin-1 and TRAF6-dependent activation of TAK1 in the absence of TAB2 and TAB3[J].Biochem J，2017，474（13）：2235-2248.

[21]Schwarz T，Murphy S，Sohn C，et al.C-TAK1 interacts with microphthalmia-associated transcription factor，Mitf， but not the related family member Tfe3[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，394（4）：890-895.

[收稿日期]2018-12-13

本文引用格式：劉彩玉，楊麗亞.蘿卜硫素通過下調(diào)Traf6/TAK1信號傳導抑制UVB誘導黑素生成的機制研究[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（3）：96-99.