王 培, 王鳳濤, 常洪雷, 馮 晶, 郭青云, 藺瑞明*

1.青海大學農林科學院, 青海省農林科學院, 農業(yè)農村部西寧作物有害生物科學觀測實驗站; 青海省農業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室; 省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室, 西寧 810016;2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室; 農業(yè)農村部作物有害生物綜合治理重點實驗室, 北京 100193;3.北京迪?？萍加邢薰? 北京 101116

轉錄因子(transcription factor，TF)又稱反式作用因子，是一類能與真核基因啟動子區(qū)域中的一段DNA序列(即順式作用元件)發(fā)生特異性結合從而調控基因轉錄起始頻率的DNA結合蛋白。近年來，已經從植物中相繼分離出一系列的轉錄因子，其中，植物特有的NAC轉錄因子是一個具有多種生物學功能的轉錄因子家族。第1個NAC類轉錄因子NAM克隆自矮牽牛[1]，隨后在擬南芥中發(fā)現了NAM、ATAF1/2和CUC2 3個具有相同結構域的基因，取這3個基因的首字母將該結構域命名為NAC結構域，并將包含NAC結構域的蛋白質稱為NAC轉錄因子[2]。NAC結構域包含5個亞結構域(A～E)，其中A、C、D 3個亞結構域高度保守，而B和E亞結構域變異性較強[3]。擬南芥基因組和水稻基因組中分別有117個[4]和151個[5]NAC轉錄因子。Ooka等[4]根據NAC結構域的氨基酸序列的相似度將其發(fā)現的水稻和擬南芥的NAC轉錄因子分為2組：Ⅰ組和Ⅱ組；并將Ⅰ組進一步分為14個亞組，Ⅱ組分為4個亞組。諸多研究表明，NAC轉錄因子在植物生長、發(fā)育和抗逆、抗病過程中起著重要作用[6～9]。

大多數NAC轉錄因子定位在細胞核，但是有一些NAC轉錄因子具有含α螺旋的跨膜基序(transmembrane motif，TM)，可編碼蛋白定位在植物細胞的膜系統(tǒng)，因此命名為NTL(NAC with transmembrane motif 1-like，NTM1-like)。目前，擬南芥中已鑒定出18個NTLs，水稻中有5個NTLs，大豆中有15個NTLs。正常條件下NTLs主要錨定在質膜或內質網膜上，但當植物遭受環(huán)境或其他因子刺激后，NTLs蛋白將從質膜或內質網膜上切除下來進入細胞核調控相關基因的表達。已有研究表明，NTLs基因參與生長發(fā)育[10]、非生物脅迫[3,11～13]以及生物脅迫[14,15]。

小麥(Triticumaestivum)是我國重要的糧食作物，隨著人們對農業(yè)環(huán)境的日益重視，開展作物抗逆抗病機理研究以培育抗逆抗病新品種對于保證小麥產量的穩(wěn)定愈發(fā)迫切。目前關于小麥NTLs基因的研究較少，僅報道了2個TaNTL轉錄因子[3,15]，且具體的生物學功能尚不完善。本研究基于基因組數據擬采用生物信息學的手段，通過全基因組鑒定、理化性質預測、系統(tǒng)發(fā)育分析、保守結構域預測、亞細胞定位預測等對小麥中的NTL轉錄因子進行綜合研究，并分析其在小麥與條銹菌互作過程中的表達變化，以期為下一步挖掘小麥中NTL轉錄因子的抗病功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 TaNTL轉錄因子的鑒定及理化性質預測

從Ensembl的植物數據庫下載截至2019年1月4日更新的小麥基因組數據(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-42/fasta/triticum_aestivum/)的全基因組序列、蛋白質序列、染色體信息文件。

下載Pfam數據庫構建NAC家族的隱馬爾可夫模型(hidden Markov model，HMM)文件，并利用HMMER 3.0軟件包中的Hmmerseach程序對小麥的全基因組進行比對，以獲取小麥基因組中包含NAC保守結構域的所有基因。隨后利用初篩的小麥NAC轉錄因子序列重新構建新的隱馬爾可夫模型，再以新的隱馬爾可夫模型在小麥全基因組序列中利用Perl語言搜索NAC轉錄因子的序列(E<10-5被認為是候選序列)。進一步利用Pfam數據庫去除不含NAC結構域的候選序列，獲得全基因組水平內所有的NAC家族轉錄因子。再利用跨膜結構域預測工具TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測獲得的小麥NAC轉錄因子是否具有跨膜結構域。

利用ExPASY-ProtParam在線工具(https://www.expasy.org/)分析小麥中NAC蛋白的基本理化性質，主要包括氨基酸數目(number of amino acids)、分子量(molecular weight)、等電點(PI)、平均親水系數(grand average of hydropathicity)、不穩(wěn)定指數(instability index)。

1.2 TaNTLs與其他NTLs的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA7.0[16]對候選小麥TaNTL轉錄因子保守區(qū)域氨基酸序列進行多序列比對，用最大似然法構建小麥、擬南芥、水稻、玉米的NTL轉錄因子保守區(qū)域的系統(tǒng)進化樹，將Bootstrap值設為1 000以獲得更為可靠的分支聚類。

1.3 TaNTLs蛋白質保守基序、轉錄本分析及染色體定位

利用蛋白質保守基序在線搜索程序MEME(http://meme-suite.org/)分析TaNTL轉錄因子家族的保守基序。每個序列可包含任何數量的基序，且不發(fā)生重疊，不同基序的數目為20個，基序長度為6～100 aa。

將已鑒定的TaNTLs基因的CDS序列與其對應的基因組序列進行比對，利用基因結構顯示系統(tǒng)(Genne structure display server 2.0，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析其外顯子-內含子(exon-intron)結構及相位。

為了獲得小麥TaNTL轉錄因子家族的染色體分布情況，利用Perl程序解析釋放出每個候選成員基因組位置信息。進而利用在線繪圖工具(Map Gene 2 Chrom web V2，http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)繪制小麥NTL轉錄因子家族在染色體上的位置分布圖。

1.4 TaNTL轉錄因子家族的亞細胞定位及表達譜分析

為了明確小麥NTLs編碼蛋白具體定位的細胞器，本研究通過PSORT在線工具(https://wolfpsort.hgc.jp/)對TaNTL膜結合轉錄因子蛋白的亞細胞定位進行了預測分析。WoLF PSORT是用于蛋白質亞細胞位置預測的POORT程序的擴展。將蛋白質序列轉換為數值，然后使用分類器進行定位預測。結果的呈現方式有2種，一種是與查詢最相似的定位特征的已知定位的蛋白質列表，另一種是具有關于個體定位特征的詳細信息的列表。

為了進一步解析小麥NTL基因家族的表達模式，利用在線分析工具(http://www.wheat-expression.com/)分析17個TaNTLs在小麥與條銹菌互作及小麥經病原物模擬處理后基因表達量的變化。

2 結果與分析

2.1 TaNTL轉錄因子的鑒定及編碼蛋白質理化性質、亞細胞定位預測

在小麥基因組中共鑒定出448個NAC轉錄因子，其中具有跨膜結構的轉錄因子有17個。這17個TaNTLs中最長的序列有730個氨基酸殘基，最短的有454個氨基酸殘基，等電點的范圍在4.50～6.12之間。

亞細胞定位與蛋白質的功能存在著非常重要的聯(lián)系。WoLF PSORT能提供準確的亞細胞定位預測。結果顯示，TaNTLs既有細胞核定位信號又有內質網和細胞膜定位信號。其中，TraesCS3B01G208300.1、TraesCS3D01G183900.2在細胞核及質膜上均無定位信息，但在內質網膜上存在定位信息，具體見表1。

表1 17個TaNTLs轉錄因子編號、編碼的蛋白質性質分析及定位預測Table 1 Gene number, coding protein characterization and predicted location of 17 TaNTLs.

2.2 TaNTL轉錄因子的系統(tǒng)發(fā)育分析與染色體來源

為了比較小麥中TaNTLs與擬南芥、水稻NTLs基因序列間的關系，利用最大似然法構建了18個擬南芥NTLs(AtNTLs)、5個水稻NTLs(OsNTLs)和上述17個TaNTLs編碼蛋白序列的聚類樹(圖1)。由圖1可見，17個TaNTLs可以分為6個同源基因組。根據水稻和擬南芥的NTLs的名稱對17個小麥NTLs命名，即命名時，參考與待命名小麥NTL距離最近的擬南芥或水稻NTL的名稱。TaNTL2包括7A、7B和7D 3個同源基因；TaNTL3包括3A、3B和3D 3個同源基因，其中TaNTL3-3B為已報道的TaNAC8[15]；TaNTL4包括5A和5D 2個同源基因；TaNTL5包括7B、7D和染色體信息未知的3個同源基因，其中染色體信息未知的基因為已報道的TaNTL5[3]，很可能是位于7A染色體；TaNTL6包括6A、6B和6D 3個同源基因；TaNTL9包括7A、7D 2個同源基因；TaNTL9-4A僅有1個基因，來源于4A染色體，但該基因編碼蛋白與TaNTL9-7A、TaNTL9-7D的序列高度相似，推測可能發(fā)生了非同源染色體的基因復制事件。

圖1 小麥與擬南芥、水稻NTLs轉錄因子編碼蛋白質的聚類分析Fig.1 The phylogenetic tree of NTLs from wheat, Arabidopsis and rice.

從NTLs在同源染色體組的分布來看(圖1)，A、B、D的同源染色體組分別有7個、4個、6個，表明B染色體組可能在進化過程中發(fā)生了NTLs的丟失事件。而對1～7號染色體組來說，來源于小麥7號染色體的NTLs有TaNTL2、TaNTL5、TaNTL9，同源基因共8個；3號染色體及6號染色體各有3個;4號染色體有1個；5號染色體有2個。相對于3、6、5號染色體，7號染色體上NTLs的基因活躍度更高。

根據擬南芥及水稻的NTLs研究[17]及聚類樹的關系，將40個NTLs分為4個亞組：NAC2、ANAC001、TIP和OsNAC8。NAC2亞組包括20個NTLs，已進行生物學功能研究的有8個：OsNTL5抑制水稻開花[10]，TaNTL5-U/TaNTL5的表達在干旱、鹽脅迫下表達受到抑制[3]，NTL4參與葉片衰老并通過JA信號通路調控花藥的開裂[11,18]，NTL11參與類黃酮合成[19]，ANAC050和ANAC052抑制開花時間[20]，NTL1(ANAC013)[21,22]和NTL7[12,13]參與線粒體脅迫和氧化脅迫調控；ANAC001亞組有6個，均源自擬南芥，其中NTL8參與毛狀體形成及鹽脅迫[12,13]，NTL14參與細胞死亡[23]；TIP亞組有10個，NTL9參與逆境脅迫及抗病免疫[14,24]，NTL6參與內質網脅迫[25,26]；OsNAC8亞組有4個，全部為小麥和水稻的NTLs，TaNAC3-3B/TaNAC8可響應條銹菌侵染和非生物脅迫[15]。

2.3 TaNTLs蛋白質保守基序和轉錄本分析

保守基序(conserved motif)是具有特定功能的蛋白結構，每個基序都有其特征性的氨基酸序列以發(fā)揮其功能。小麥NTLs編碼蛋白質序列的保守基序分析結果顯示，小麥NTLs均含有保守基序Motif 1、Motif 2、Motif 3。Motif 18和Motif 19為較為保守的結構域，其中Motif 18只存在于TracesCS5A01G271500.2(TaNTL4-5A)，推測其功能不同于其他轉錄因子。結合17個TaNTLs的聚類樹，可以發(fā)現親緣關系較近的NTLs具有相似的保守基序，具體見圖2。

基因組序列由內含子(intron)和外顯子(exon)構成，外顯子為基因的可編碼序列。為了進一步研究基因結構，分析了小麥中NTL的exon-intron分布(圖2)。結果表明，小麥NTL基因一般有4～7個外顯子，蛋白序列親緣關系較近的NTLs具有相似的exon-intron結構。A、B、D同源基因的exon-intron的模式相似，但是內含子長度存在差異。

圖2 小麥NTL轉錄因子家族的保守基序及基因結構Fig.2 Conserved motifs and gene structure of NTLs in wheat.

2.4 TaNTLs在小麥與條銹菌互作過程中表達譜分析

為了分析TaNTLs在小麥響應病原菌侵染過程中的表達模式，本研究基于已知的小麥-條銹菌親和互作、小麥-病原物模擬接種的轉錄組數據庫，進行表達譜分析。研究結果表明(圖3)，在小麥-條銹菌親和互作過程中，9個TaNTLs的表達水平發(fā)生顯著變化，根據響應條銹菌侵染的早期(2 d及以內)和晚期可將其分為2類，其中，5個TaNTLs在親和條銹菌侵染小麥的早期表達水平升高：TaNTL3-3A(TraesCS3A02G176500.1)、TaNTL3-3B(TraesCS3B02G208300.2)、TaNTL3-3D(TraesCS3D02G183900.2)、TaNTL5-7D(TraesCS7-D02G283800.1)、TaNTL6-6D(TraesCS6D02-G390200.1)，8個TaNTLs在條銹菌侵染11 d時(條銹菌夏孢子堆已經完全擴展到小麥葉片內部)表達水平顯著升高：TaNTL3-3A(TraesCS3A02G176500.1)、TaNTL3-3B(TraesCS-3B02G208300.2)、TaNTL3-3D(TraesCS3D02-G183900.2)、TaNTL5-U(TraesCSU02G135000.1)、TaNTL5-7D(TraesCS7D02G283800.1)、TaNTL6-6A(TraesCS6A02G406700.1)、TaNTL6-6B(TraesCS-6B02G451300.1)、TaNTL9-7D(TraesCS7D02G0-00200.1)。尤其是TaNTL6-6A(TraesCS6A02-G406700.1)，其本底水平不高，但在11 d時達到最高表達水平。此外，同源群內的基因對親和條銹菌侵染的響應存在差異，如接種親和條銹菌后，TaNTL5-U與TaNTL5-7D的表達水平顯著升高，而TaNTL5-7B的表達變化不大；TaNTL9-7D的表達顯著升高，TaNTL9-7A、TaNTL9-7B的表達變化不大。由此推測，來源于A、B、D不同染色體組的NTLs在進化過程中可能由于啟動子、上游調控序列或DNA甲基化水平存在差異導致親和條銹菌侵染后的表達水平存在差異。

基于小麥-病原物模擬接種的轉錄組數據庫分析表達譜變化(圖3)，結果表明，小麥接種幾丁聚糖和鞭毛多肽后，TaNTL3-3A、TaNTL3-3B、TaNTL3-3D、TaNTL4-5A、TaNTL4-5D、TaNTL6-6A和TaNTL6-6D的表達水平升高。

圖3 TaNTLs在小麥與條銹菌互作及病原物模擬處理后的表達譜分析Fig.3 The expression pattern of TaNTLs responsing wheat-sripe rust infection and pathogen-associated molecular treatment.

3 討論

本研究搜集了小麥基因組數據，獲得了17個TaNTLs。其中TaNTL5-U為之前報道的TaNTL5[3]，TaNTL3-3B為TaNAC8[15]。相比水稻中的5個NLTs基因，小麥多了1個同源群基因(TaNTL9)。17個TaNTLs均具有跨膜結構域，除TaNTL3-3B、3D和TaNTL5-7B、7D預測無核定位信號外，其余均含有核定位信號。通過小麥-條銹菌轉錄組及小麥-原體接種處理2個數據庫的表達譜分析，TaNTL5-7D、TaNTL6-6A和TaNTL6-6D在2種處理中均表達升高，推測這3個基因可能參與了抗病調控過程。

NTL類轉錄因子屬于NAC家族的轉錄因子，其特點是具有跨膜結構域，因此與一般轉錄因子蛋白產物定位在細胞核不同，該類轉錄因子蛋白產物一般為膜定位，如質膜、內質網膜。已有研究表明，膜結合轉錄因子的跨膜結構域的切割有2種蛋白水解機制[27]，第1種為通過膜內蛋白水解(regulated intramembrane proteolysis，RIP)機制，第2種為依賴泛素/蛋白體加工(regualated ubiquitin/proteasome-dependent processing，RUP)的調節(jié)機制。

在細胞內NTLs實現其功能的先決條件是膜釋放，其通過蛋白水解從膜上釋放，并被轉運到細胞核中調節(jié)應激反應基因的表達。對于擬南芥中NTLs功能的研究較為深入，此外玉米、大豆、水稻等的NTLs均有報道。已經明確NTLs在植物生長發(fā)育、調控逆境脅迫中發(fā)揮調節(jié)作用[27～30]。蛋白質的結構相似，其功能也可能相似，參照擬南芥和水稻的NTLs功能，小麥NTLs可能也具有不同的生物功能。根據蛋白質序列的聚類樹，推測TaNTL5和TaNTL6的3個同源基因可能在植物的發(fā)育過程中起重要作用，同時可負調控逆境脅迫；TaNTL4的2個同源基因與擬南芥的NTL1、NTL4同屬于一個亞組，可能位于線粒體膜上，可能調控線粒體、內質網內脅迫；TaNTL3中TaNTL3-3B為已報道的TaNAC8，響應條銹菌侵染和非生物脅迫；TaTNL2的3個同源基因的功能尚無參考基因推測，而TaTNL9的3個同源基因與擬南芥的NTL9序列相似，可能響應逆境脅迫和內質網脅迫。

根據表達譜分析TaNTL5-7D、TaNTL6-6A和TaNTL6-6D在小麥-病原菌互作過程中均表達升高，推測這3個基因可能參與抗病調控過程，同時結合聚類分析，推測其負調控逆境脅迫的同時在植物的發(fā)育過程中起重要作用。然而，其在小麥-病原菌互作過程中的功能尚需準確、系統(tǒng)的蛋白水平的檢測及生物學功能驗證。