孔成成 賈紅兵 段惠娟 梁倩 馬異峰 尚媛媛 孫照剛

作者單位：101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室(孔成成、賈紅兵、段惠娟、孫照剛)，國家結(jié)核病臨床實驗室(梁倩、馬異峰、尚媛媛)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)培養(yǎng)并進(jìn)行菌種鑒定是結(jié)核病病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于MTB生長緩慢，培養(yǎng)時間長，痰標(biāo)本前處理過程多且復(fù)雜，因而易受痰標(biāo)本本身和外界細(xì)菌的污染，尤其是液體分枝桿菌培養(yǎng)管(Mycobacterium growth indicator tube, MGIT)培養(yǎng)法，污染率較改良羅氏培養(yǎng)基L-J法高[1]。筆者統(tǒng)計國內(nèi)文獻(xiàn)記載的MGIT 960液體培養(yǎng)法培養(yǎng)痰標(biāo)本的平均污染率為4.13%(2.5%～6.57%)[2-11]。造成MGIT 960液體培養(yǎng)法污染率高的因素很多，如痰標(biāo)本的儲存時間長[12]、痰標(biāo)本的消化去污不徹底[13]、患者感染菌株對前處理劑耐受[14]，等等。關(guān)于痰處理液沉渣對MGIT 960液體培養(yǎng)法發(fā)生污染率的影響尚未報道。本研究通過分析不同性狀的痰處理液沉渣質(zhì)量差異及其對痰培養(yǎng)結(jié)果的影響，并對培養(yǎng)污染標(biāo)本用測序方法進(jìn)行菌種鑒定，分析污染菌種分布特點(diǎn)，以期能更好地降低污染率，提高臨床診斷率。

材料和方法

一、標(biāo)本采集

收集2018年1—2月于北京胸科醫(yī)院門診就診疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本。共入組患者162例，每例患者收集痰標(biāo)本1份，共162份，其中干酪痰和血痰標(biāo)本各20份，黏液痰標(biāo)本122份。

二、標(biāo)本分類

根據(jù)研究要求，由于唾液以透明或半透明水樣口腔分泌物為主，經(jīng)痰處理液消化處理后無沉渣，所以不對其進(jìn)行研究。參考《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[14]，痰標(biāo)本評價標(biāo)準(zhǔn)按照痰標(biāo)本性狀將其分為以下3類：(1)干酪痰：標(biāo)本外觀以黃色(或奶酪色)、膿樣、團(tuán)塊狀的肺部分泌物為主；(2)黏液痰：標(biāo)本外觀以白色、黏稠度較高的肺部和支氣管分泌物為主；(3)血痰：黏液痰或干酪痰標(biāo)本中混有血液，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲。

三、試劑儀器

BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀，其配套試劑包括分枝桿菌液體培養(yǎng)管(MGIT培養(yǎng)管)、生長添加劑、雜菌抑制劑(PANTA)(BD公司，美國)，顯微鏡(Leica，德國)，電子天平(Sartorius，德國)，離心機(jī)(Sigma，美國)，標(biāo)本前處理液為3%N-乙酰-L半胱氨酸-NaOH消化液(3% NaOH-NALC)、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(自配)，抗酸染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

四、研究方法

1.痰前處理液消化時間：根據(jù)《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[14]及文獻(xiàn)[15-18]推薦的痰消化處理最佳時間≤20 min的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合國家結(jié)核病臨床重點(diǎn)實驗室MGIT 960液體培養(yǎng)法操作流程，本研究中采用痰前處理液消化處理15 min對收集的162份痰標(biāo)本進(jìn)行消化處理。

2.痰標(biāo)本的MGIT 960液體培養(yǎng)：采用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀液體培養(yǎng)痰標(biāo)本中的MTB。(1)將收集到的162份痰標(biāo)本每份吸取10 ml分裝于2個50 ml的無菌離心管中，每管5 ml痰，兩份痰標(biāo)本均經(jīng)痰前處理液消化處理15 min。(2)痰標(biāo)本消化處理后，1份記錄沉渣質(zhì)量，1份取0.5 ml上清及0.5 ml沉渣分別接種于MGIT 960液體培養(yǎng)管中進(jìn)行培養(yǎng)，其中接種上清液到管內(nèi)即為上清接種組，接種沉渣到管內(nèi)即為沉渣接種組，MGIT 960培養(yǎng)管置于儀器中培養(yǎng)，儀器培養(yǎng)時間最長為42 d報告結(jié)果。(3)已報告培養(yǎng)結(jié)果的MGIT 960液體培養(yǎng)管，均經(jīng)涂片抗酸染色再次進(jìn)行確認(rèn)。若涂片結(jié)果顯示分枝桿菌，則最終結(jié)果判定為“真陽性”；若涂片鑒定未發(fā)現(xiàn)分枝桿菌及其他微生物，則為“真陰性”；若涂片結(jié)果顯示僅為分枝桿菌之外的其他微生物，則判定為“污染”。

3.污染標(biāo)本的菌種鑒定方法：(1)吸取污染標(biāo)本7 ml于50 ml無菌離心管中，3000×g離心15 min，去上清。(2)加20 μg/ml溶菌酶200 μl，37 ℃孵育過夜。(3)80 ℃金屬浴2 h，離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心10 min，留取上清。(4)設(shè)計引物對16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增、產(chǎn)物測序。上游引物序列5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下游引物序列5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1487 bp，以上擴(kuò)增產(chǎn)物均送睿博興科公司測序，測序結(jié)果使用BLAST進(jìn)行序列比對分析。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、不同性狀的痰標(biāo)本前處理液沉渣質(zhì)量之間的對比結(jié)果

采用方差分析法對全部162份痰標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計，分析5 ml不同性狀的痰標(biāo)本經(jīng)前處理液消化處理15 min后所得沉渣質(zhì)量差異，結(jié)果顯示，干酪痰標(biāo)本所得沉渣質(zhì)量[(0.17±0.14) g]高于黏液痰標(biāo)本[(0.09±0.07) g]和血痰標(biāo)本[(0.10±0.07) g]，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為14.56、4.29，P值分別為0.00、0.01)，血痰標(biāo)本所得沉渣質(zhì)量略高于黏液痰，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.09，P=0.80)(表1)。

二、上清接種組與沉渣接種組的檢測結(jié)果

162份痰標(biāo)本鑒定結(jié)果中，上清接種組與沉渣接種組中共同符合“真陽性”標(biāo)準(zhǔn)的痰標(biāo)本有76份，共同符合“真陰性”標(biāo)準(zhǔn)的痰標(biāo)本有53份。痰標(biāo)本沉渣接種組經(jīng)MGIT 960檢測報陽標(biāo)本共108份，報陰標(biāo)本共54份，報陽標(biāo)本經(jīng)涂片抗酸染色檢測，涂片陽性結(jié)果82份，涂片陰性結(jié)果26份，即沉渣接種組符合“污染”標(biāo)準(zhǔn)的痰標(biāo)本有26份。上清接種組經(jīng)MGIT 960檢測報陽標(biāo)本共82份，報陰標(biāo)本共80份，報陽標(biāo)本經(jīng)涂片抗酸染色檢測，涂片結(jié)果均為陽性，無涂片陰性結(jié)果，即上清接種組無符合“污染”標(biāo)準(zhǔn)的痰標(biāo)本。6例患者痰標(biāo)本在上清接種組診斷結(jié)果為真陰性而在沉渣接種組診斷結(jié)果為真陽性，1例患者痰標(biāo)本在上清接種組診斷結(jié)果為真陽性，而在沉渣接種組診斷結(jié)果為真陰性。痰處理液上清接種組與沉渣接種組培養(yǎng)結(jié)果K值為0.65(<0.75)，說明兩組培養(yǎng)結(jié)果的一致性一般。沉渣接種組污染率(16.05%，26/162)高于上清接種組(0.00%，0/162)，采取Fisher精確檢驗，結(jié)果顯示P=0.00，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表1 3種性狀的痰處理液沉渣質(zhì)量比較

注a：采用方差分析比較干酪痰與黏液痰所得的F值和P值；b：采用方差分析比較干酪痰與血痰所得的F值和P值；c：采用方差分析比較黏液痰與血痰前處理液沉渣差異所得的F值和P值

表2 痰處理液上清接種組和沉渣接種組的檢測結(jié)果

注A+：為MGIT 960液體培養(yǎng)方法陽性結(jié)果；A-：為MGIT 960液體培養(yǎng)方法陰性結(jié)果；B+：為抗酸染色鑒定結(jié)果為分枝桿菌，即涂片陽性；B-：為抗酸染色鑒定無分枝桿菌，即涂片陰性；(+)：表示“真陽性”結(jié)果；(-)：表示“真陰性”結(jié)果

表3 沉渣接種組不同性狀的痰標(biāo)本污染檢測結(jié)果

注a：采用χ2檢驗比較干酪痰與黏液痰所得的χ2值和P值；b：采用χ2檢驗比較干酪痰與血痰所得的χ2值和P值；c：采用χ2檢驗比較黏液痰與血痰污染率差異所得的χ2值和P值

表4 26例污染標(biāo)本菌種鑒定結(jié)果及在不同性質(zhì)的痰標(biāo)本中的分布情況

注“-”為未檢測出相應(yīng)菌株

沉渣接種組中，血痰標(biāo)本、干酪痰標(biāo)本和黏液痰標(biāo)本的污染率存在差異，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.61，P=0.00)，其中血痰標(biāo)本污染率最高，為50.00%(10/20)，其次為干酪痰標(biāo)本(15.00%，3/20)，黏液痰標(biāo)本最低(10.66%，13/122)。血痰標(biāo)本污染率分別與黏液痰標(biāo)本和干酪痰標(biāo)本相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為19.60、4.10，P值分別為0.00、0.04)。而干酪痰標(biāo)本和黏液痰標(biāo)本污染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.04，P=0.70)(表3)。

三、26例污染標(biāo)本的菌種鑒定結(jié)果

26例患者的污染標(biāo)本中有21例有測序結(jié)果，其余5例患者的標(biāo)本未擴(kuò)增出基因組DNA。 有明確測序結(jié)果的污染標(biāo)本中，芽孢桿菌和鏈球菌較為突出，分別占23.08%(6/26)和15.38%(4/26)。其次，小韋榮球菌和奈瑟菌分別占11.54%(3/26)和7.69%(2/26)。其中黏液痰污染菌種主要集中在芽孢桿菌、鏈球菌和小韋榮球菌，而血痰和干酪痰污染菌種分布不集中(表4)。

討 論

MTB培養(yǎng)陽性并進(jìn)行菌種鑒定是實驗室診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，MGIT 960液體培養(yǎng)法對MTB培養(yǎng)具有操作簡單、報告陽性時間比固體L-J培養(yǎng)法短等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于臨床檢測，但培養(yǎng)過程中污染率高也對診療帶來極為不利的后果，是最突出的缺點(diǎn)。包括痰處理液組成[19]、培養(yǎng)管抑菌劑[20]等造成污染的原因已有報道，本研究進(jìn)一步探討痰標(biāo)本前處理液處理后的沉渣對MGIT 960液體培養(yǎng)污染率的影響。

一、痰標(biāo)本前處理液沉渣對MGIT 960液體培養(yǎng)法診斷結(jié)果的影響分析

162份痰標(biāo)本處理液中，沉渣接種組標(biāo)本污染率為16.05%(26/162)，高于上清接種組(0.00%，0/162)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，沉渣接種組污染率高，說明沉渣接種是造成MGIT 960培養(yǎng)陽性結(jié)果過高的主要原因之一。分析沉渣接種造成污染的原因主要有以下3點(diǎn)：(1)痰處理液沉渣中含有的雜菌數(shù)量較多[13]；(2)痰處理液對沉渣中的雜菌影響較小[13]；(3)培養(yǎng)過程中，沉渣中的雜菌對抗生素不敏感[13]。因此建議接種前預(yù)先靜置前處理液，接種時盡量避免接種前處理液的沉渣。

沉渣接種組26例患者的污染標(biāo)本中，不同性狀的痰標(biāo)本培養(yǎng)污染率不同，雖然血痰的痰處理液沉渣少于干酪痰，但血痰的MGIT 960液體培養(yǎng)污染率最高，干酪痰次之，黏液痰污染率最低。分析原因可能為血痰污染標(biāo)本患者并發(fā)肺部感染者較高50.00%(10/20)，這與白大鵬[21]報道相一致。干酪痰患者肺部感染率最低，3份污染標(biāo)本患者中有1例并發(fā)肺部感染，培養(yǎng)結(jié)果受感染菌株影響小。黏液痰患者雖然肺部感染較多(38.46%，5/13)，但黏液痰消化去污相對容易，沉渣少，致使培養(yǎng)污染率最低。根據(jù)《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[14]要求MGIT 960液體培養(yǎng)污染率應(yīng)不超過5%，本研究沉渣接種組的污染率達(dá)到16.05%(26/162)，其原因除前述分析中提到的3點(diǎn)主要原因外，與收集到的標(biāo)本類型也具有一定相關(guān)性，本研究標(biāo)本中血痰標(biāo)本(12.35%，20/162)和干酪痰標(biāo)本(12.35%，20/162)所占比率較高。

二、沉渣接種組26份污染標(biāo)本的菌種鑒定結(jié)果分析

在鑒定造成MGIT 960液體培養(yǎng)污染的菌種時有5份污染標(biāo)本未擴(kuò)增出DNA，分析其原因可能為標(biāo)本由多種細(xì)菌混合污染，導(dǎo)致DNA測序失敗。剩余21份MGIT 960液體培養(yǎng)污染標(biāo)本經(jīng)菌種鑒定，發(fā)現(xiàn)造成MGIT 960液體培養(yǎng)污染的菌種以芽孢桿菌、鏈球菌、小韋榮球菌和奈瑟菌為主，還包括腸球菌、銅綠假單胞菌、干酪乳桿菌和Anaerospora，提示培養(yǎng)污染率高與患者肺部感染[22]和口腔細(xì)菌有關(guān)。本研究中革蘭陽性菌屬占污染菌種的61.9%(13/21)，是造成污染的主要組成部分，與吳龍章等[14]報道相符，但造成污染的主要菌種不相符，分析原因為檢測方法不同，造成與報道之間存在一定差別。

三、本研究的不足

(1)本研究標(biāo)本量相對較少，且標(biāo)本全部來源于門診患者，所得結(jié)果可能存在偏差。有待進(jìn)一步增加標(biāo)本量以及豐富標(biāo)本來源進(jìn)行深入探討，以更好地找出MGIT 960液體培養(yǎng)污染的來源，從而降低污染率，為臨床痰培養(yǎng)工作提供一定的參考。(2)本研究痰處理液沉渣通過無菌吸管吸出全部上清后獲得，所獲結(jié)果會存在偏差，有待進(jìn)一步完善和改進(jìn)試驗方法。

綜上所述，痰標(biāo)本前處理液沉渣是MGIT 960液體培養(yǎng)污染率高的主要原因之一，因此應(yīng)盡量避免沉渣的接種。同時應(yīng)注意肺部感染的患者，痰標(biāo)本培養(yǎng)污染率也會增加，因此對伴有呼吸道感染的患者應(yīng)加強(qiáng)肺部抗炎治療，待感染控制后再送標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)。另外，建議以生理鹽水加3%雙氧水漱口后取痰標(biāo)本，以此減少口腔細(xì)菌污染[23]。

志謝首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院流行病學(xué)研究室康萬里研究員對論文數(shù)據(jù)處理提供了多方面的幫助與指導(dǎo)。