孫昌瑞,馮 林

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610072；2.四川省婦幼保健院檢驗(yàn)科，四川成都 610091)

全世界15% 的育齡夫婦不孕不育，而男性因素占30%～40%，其中精子異常占了14%～15%[1-3]。越來越多的研究表明，魚精蛋白的表達(dá)與精子的形成、活力和染色體有密切相關(guān)性[4-5]，魚精蛋白的組成成分缺失、含量過低或過高溫度，都會(huì)導(dǎo)致精子DNA斷裂或組成比例異常,使得精子DNA損傷加劇[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)在成都地區(qū)男性不育的調(diào)查報(bào)告中，未見有關(guān)于魚精蛋白1(PRM1)和魚精蛋白2(PRM2)的mRNA表達(dá)的報(bào)道，因此，本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)方法，檢測(cè)了男性體檢健康者30例、少精子癥83例、畸形精子癥61例的不育患者的精子PRM1和PRM2 mRNA表達(dá)情況，用基因分析方法來探討成都地區(qū)男性不育患者少精子癥與魚精蛋白基因表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取年齡24～36歲的男性體檢健康者30例作為體檢健康組，年齡24～35歲的83例少精子不育癥患者作為少精子癥組，年齡23～36歲的畸形精子不育癥患者61例作為畸形精子癥組。不育癥患者均來自本院生殖輔助研究中心，采集標(biāo)本前研究對(duì)象禁欲3～5 d，采集后在37 ℃、20～30 min液化完全后，采用計(jì)算機(jī)精液分析系統(tǒng)和巴氏改良染色法進(jìn)行檢測(cè)，不育癥患者均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)第5版不育癥臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除由染色體核型異常、Y染色體微缺失、隱睪、生殖系統(tǒng)感染、阻塞性無精子癥、性腺發(fā)育不良、免疫或內(nèi)分泌疾病等引起的不育患者。所有標(biāo)本均需本人簽署醫(yī)學(xué)倫理知情同意書。

1.2精液純化和提取RNA 將液化后的精液標(biāo)本離心后棄上清，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)反復(fù)混勻，離心，棄上清，重復(fù)2～3次。采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA，檢測(cè)RNA濃度、純度及完整性。

1.3FQ-PCR引物 采用PE公司Primer Express軟件設(shè)計(jì)PRM1、PRM2和GAPDH引物序列，由廣州達(dá)安基因生物公司合成。PRM1的序列如下，F(xiàn)：CAG CCC ACA GAG TTC CAC CT，R：GCA CCT CAT GGC TCT CCT C；PRM2的序列，F(xiàn)：GCA AGA GCA AGG ACA CCA C，R：AGC CTC TGC GAT GCC TCC T；GAPDH的序列，F(xiàn)：GCC AGT GGA CTC CAC GAC，R：CAA CTA CAT GGT TTA CAT GTT C。

1.4cDNA合成 FQ-PCR反應(yīng)體系(美國(guó)Invitrogen公司)20 μL：總RNA 1 μg，反轉(zhuǎn)錄酶20 U，隨機(jī)引物200 ng，5×反應(yīng)緩沖液4 μL，42 ℃反應(yīng)50 min。

1.5FQ-PCR反應(yīng) 擴(kuò)增PRM1、PRM2和GAPDH，循環(huán)條件：50 ℃ 2 min,95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，循環(huán)40次，72 ℃末次延伸5 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：采用BIECHE的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，在每次擴(kuò)增均使用標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，范圍為102～106copy/mL[9]。定量分析：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器自動(dòng)計(jì)算出標(biāo)本中PRM1、PRM2和GAPDH的每毫升拷貝數(shù)，以PRM1、PRM2和GAPDH比值作為PRM1和PRM2的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1PRM1和PRM2在精液中的表達(dá) 以GAPDH為內(nèi)參基因，分別計(jì)算體檢健康組、少精子癥組和畸形精子癥組PRM1和PRM2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，精液中PRM1和PRM2在少精子癥組精液中表達(dá)率顯著低于體檢健康組和畸形精子癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；體檢健康組和畸形精子癥組PRM1和PRM2表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組PRM1和PRM2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

注：與體檢健康組比較,*P<0.05；與畸形精子癥組比較，#P<0.05

表2 PRM1和PRM2單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)用于少精子癥

2.2PRM1和PRM2檢測(cè)用于診斷少精子癥的靈敏度和特異度 結(jié)果初步顯示，將PRM1和PRM2聯(lián)合檢測(cè)，可提高對(duì)少精子癥診斷的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值，見表2。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們更多地從遺傳學(xué)角度對(duì)男性不育進(jìn)行分析，比如染色體畸變、單基因突變、Y 染色體微缺失、遺傳多態(tài)性等[10-11]，其中將魚精蛋白的核酸和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析研究，成為特發(fā)性男性不育的一大熱點(diǎn)，魚精蛋白廣泛存在于人類及其他許多物種精子中，是含有豐富精氨酸的堿性蛋白質(zhì)，1874年有研究者發(fā)現(xiàn)并成功的將其從精子中分離出來，編碼PRM1和PRM2的基因位于16p13.3(16號(hào)染色體短臂)，相對(duì)分子質(zhì)量大約4×103～7×103，魚精蛋白與精子生成、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、受精卵發(fā)育等緊密相關(guān)[12]。

PRM1有50個(gè)氨基酸殘基，在N 末端有1個(gè)高度保守區(qū)，和4個(gè)高度保守的精氨酸組成的中央核心區(qū)，PRM2 富有的精氨酸和組氨酸殘基，臨床研究表明，PRM1表達(dá)量與精子的產(chǎn)生有密切的關(guān)聯(lián)，當(dāng)它的表達(dá)量異常時(shí)，會(huì)出現(xiàn)精子發(fā)育失調(diào)導(dǎo)致精子數(shù)量減少，而PRM2表達(dá)異常會(huì)改變精子負(fù)電荷量，降低精子染色質(zhì)的凝聚穩(wěn)定性，造成DNA的損傷[13-14]。MILLER等[15]研究報(bào)道，PRM可以保護(hù)精子 DNA，使其免受損傷，這是受精成功的關(guān)鍵因素之一。李俊等[16]采用限制性酶切及DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)PRM1 C321A位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)不育患者PRM1 C321A位點(diǎn)AA基因型頻率顯著高于生育男性，導(dǎo)致精子前向運(yùn)動(dòng)能力及正常形態(tài)比例等參數(shù)明顯下降,可能是男性不育的主要因素。

目前對(duì)成都地區(qū)男性不育的流行病學(xué)調(diào)查中，尚未見關(guān)于魚精蛋白基因表達(dá)和少精子癥相關(guān)性的報(bào)道，本研究分別檢測(cè)了體檢健康組、少精子癥組和畸形精子癥組PRM1和PRM2 mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)PRM1和PRM2在少精子癥組的表達(dá)率顯著低于體檢健康組和畸形精子癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而在體檢健康組和畸形精子癥組表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)異意義(P>0.05)，提示PRM1 和PRM2 mRNA表達(dá)水平降低極可能是造成精子數(shù)量減少而不是精子形態(tài)異常的原因，這一結(jié)果，與國(guó)內(nèi)學(xué)者洪丹等[17]的報(bào)道是一致的，即PRM1和PRM2 mRNA表達(dá)量減少可能影響精子染色質(zhì)包裝，使得精子形成過程異常，從而導(dǎo)致成熟精子數(shù)量減少。另一方面，聯(lián)合檢測(cè)PRM1 和PRM2，可提高對(duì)少精子癥診斷的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值。

4 結(jié) 論

采用FQ-PCR檢測(cè)精液中PRM1 和PRM2 mRNA表達(dá)，方法簡(jiǎn)便易行，價(jià)格便宜，標(biāo)本來源容易，不會(huì)給患者帶來痛苦，為個(gè)體化治療提供遺傳性依據(jù)，同時(shí)，也可以進(jìn)行較大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，探究遺傳異常發(fā)生類型及分布特點(diǎn)，較為全面的評(píng)估無精子癥、少精子癥患者的遺傳學(xué)缺陷，為輔助生殖患者提供治療前的遺傳咨詢，為臨床治療方案的選擇夯實(shí)基礎(chǔ)。