杜政德 熊偉 于樹夔 柳柯 龔樹生

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉科（北京100050）

老年性聾是聽覺外周和聽覺中樞年齡相關(guān)性退行性變[1]。中樞聽覺系統(tǒng)的退行性變可影響聽覺感知能力和言語識別能力[2]。由于聽覺系統(tǒng)的組織不可能在人類活體取得，以及老化是一個長期緩慢的過程。因此，耳科學(xué)研究者利用很多衰老動物模型研究老年性聾的發(fā)病機制及干預(yù)。其中，D-半乳糖誘導(dǎo)的快速衰老動物是研究老年性聾較為理想的動物模型[3-5]。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶是D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽覺中樞活性氧的重要來源[4,6]；在老化的過程中，NADPH氧化酶相關(guān)的活性氧可導(dǎo)致聽覺中樞神經(jīng)元線粒體氧化損傷，并啟動依賴線粒體的細(xì)胞凋亡途徑[4,6,7]。

目前，聽覺系統(tǒng)年齡相關(guān)性退行性變的發(fā)病機制尚不完全清楚，有關(guān)聽覺中樞老化相關(guān)機制及干預(yù)的研究相對較少。在本研究中，我們將使用NADPH氧化酶的抑制劑羅布麻寧（Apocynin,APO）[8,9]，研究羅布麻寧對D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層氧化損傷的作用。本研究將進(jìn)一步揭示NADPH氧化酶在聽覺中樞老化過程中的作用，為老年性聾的發(fā)病機制的研究提供新的思路，為老年性聾的干預(yù)研究提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 動物和處理

36只1月齡雄性Sprague-Dawley大鼠購自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為3組：①對照組：大鼠頸背部皮下注射生理鹽水，每日1次，連續(xù)8周；②D-半乳糖組：大鼠頸背部皮下注射500mg/kg D-半乳糖（sigma，美國），每日1次，連續(xù)8周；③D-半乳糖+羅布麻寧組：大鼠頸背部皮下注射500mg/kg D-半乳糖+腹膜內(nèi)注射50mg/kg羅布麻寧，每日1次，連續(xù)8周。所有動物均飼養(yǎng)在室溫約20-22°C左右，12h晝夜交替的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。兩組動物均無噪聲暴露史，無其它藥物使用史。所有實驗動物的飼養(yǎng)和研究嚴(yán)格遵守首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理規(guī)定。

1.2 氧化應(yīng)激水平的評估

酶化學(xué)法檢測H2O2和總超氧化物歧化酶（Total superoxidedismutase,T-SOD）活性，評估各組大鼠（每組4只）聽皮層組織氧化應(yīng)激水平。H2O2和T-SOD活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 線粒體DNA氧化損傷產(chǎn)物的檢測

免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基-2-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG）[10]和線粒體內(nèi)參蛋白COX IV，評估聽皮層線粒體DNA氧化損傷。各組大鼠（每組4只）肌肉注射氯胺酮（30 mg/kg）和氯丙嗪（15 mg/kg）麻醉。0.1 M磷酸鹽緩沖液（PBS）心臟快速灌注SD大鼠，繼而4%多聚甲醛心臟灌注，取出腦組織，4℃冰箱固定過夜。第二天，將標(biāo)本置于30%蔗糖溶液中脫水至腦組織沉底，OCT包埋腦組織，行冠狀位切除至聽皮層層面，厚度約10μm。聽皮層組織切片放置于室溫晾干，0.1 M PBS浸泡5min去除OCT后將切片置于0.3%Triton X-100+2%BSA（bovine serum albumin，牛血清白蛋白）中 破膜和封閉30min，加入小鼠來源的8-OHdG（1：500稀釋，Abcam，美國）和COX IV（1:500稀釋，Proteintech，中國）一抗4℃過夜，PBS沖洗3次；加入合適的二抗，37℃避光染色1h，PBS沖洗3次，含DAPI（標(biāo)記細(xì)胞核）的封片劑封片激光共聚焦顯微鏡掃描。

1.4 線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察

各組大鼠（每組4只）肌肉注射氯胺酮（30 mg/kg）和氯丙嗪（15 mg/kg）麻醉后，處死大鼠，快速取出聽皮層組織，置于2.5%戊二醛4℃固定過夜。0.1 M PBS沖洗，1%鋨酸中室溫下后固定2h，0.1磷酸緩沖液沖洗，上行梯度乙醇（50%、70%、90%乙醇各5min）、90%乙醇丙酮、90%丙酮5分鐘，100%丙酮脫水5min。然后，浸入丙酮+環(huán)氧樹脂812（1:1），再浸入環(huán)氧樹脂812中2h，最后環(huán)氧樹脂812中80℃包埋10h。用超薄切片機（Leica ultracut UTC,Germany）超薄切片（50nm），超薄切片置于300網(wǎng)孔的銅載網(wǎng)上，1%醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛中各染色10min，最后透射電子顯微鏡下觀察各組大鼠聽皮層線粒體的形態(tài)。

1.5 線粒體功能的評估

酶化學(xué)法檢測ATP和線粒體膜電位，評估各組大鼠（每組4只）聽皮層組織線粒體功能。ATP和線粒體膜電位檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0（SPSS Inc.,美國）統(tǒng)計軟件行多因素的方差分析，所有實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羅布麻寧減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層氧化應(yīng)激水平

對照組、D-半乳糖組和D-半乳糖+羅布麻寧組大鼠聽皮層H2O2水平分別為14.98±1.15 mmol/g protein、32.87±2.20 mmol/g protein和20.00±1.86 mmol/g protein，D-半乳糖組比對照組顯著升高（F=17.898,P＜0.01），而D-半乳糖+羅布麻寧組比D-半乳糖組則顯著降低（F=-12.873,P＜0.01）（圖1A）；對照組、D-半乳糖組和D-半乳糖+羅布麻寧組大鼠聽皮層T-SOD活性水平分別為134.92±16.32 U/mg protein、75.80±10.76 U/mg protein和101.93±16.35 U/mg protein，D-半乳糖組比對照組顯著降低（F=-59.128,P＜0.01），而D-半乳糖+羅布麻寧組比D-半乳糖組則顯著升高（F=26.138,P＜0.05）（圖1B）。

圖1 （A）各實驗組大鼠聽皮層H2O2水平；（B）各實驗組大鼠T-SOD活性水平。*P＜0.05，**P＜0.01。Control：對照組；D-gal：D-半乳糖組；D-gal+APO：D-半乳糖+羅布麻寧組；T-SOD：總超氧化物岐化酶。Fig.1 (A)Levels of H2O2in the auditory cortex of rats in different groups;(B)Levels of T-SOD activity in the auditory cortex of rats in different groups.*P＜0.05,**P＜0.01.APO,apocynin.D-gal,D-galactose.T-SOD,total superoxide dismutase.

2.2 羅布麻寧減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層線粒體DNA氧化損傷

通過免疫組織化學(xué)染色激光共聚焦顯微鏡成像我們發(fā)現(xiàn)各實驗組大鼠聽皮層DNA氧化損傷標(biāo)記物8-OHdG主要表達(dá)在COX IV標(biāo)記的線粒體中，且D-半乳糖組比對照組顯著升高（F=4.468,P＜0.01），而D-半乳糖+羅布麻寧組比D-半乳糖組則顯著降低（F=-3.253,P＜0.01）（圖2A、B）。

圖2 （A）DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG（紅色）在聽皮層組織的表達(dá)，COX IV（綠色）標(biāo)記線粒體，DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記細(xì)胞核；（B）定量分析 8-OHdG 的表達(dá)。標(biāo)尺=20 μm。**P＜0.01。Control：對照組；D-gal：D-半乳糖組；D-gal+APO：D-半乳糖+羅布麻寧組。Fig.2 (A)The expression of 8-OHdG(red),a production of DNA oxidative damage,in the auditory cortex.COX IV(green)marks mitochondria.DAPI(blue)marks nuclei.(B)Quantitative analysis of 8-OHdG in the auditory cortex.Scale bar=20 μm.**P＜0.01.8-OHdG,8-hydroxy-2-deoxyguanosine.APO,apocynin.D-gal,D-galactose.

2.3 羅布麻寧減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷

透射電子顯微鏡觀察各實驗組大鼠聽皮層線粒體超微結(jié)構(gòu)，對照組大鼠聽皮層線粒體結(jié)構(gòu)完整，線粒體基質(zhì)電子密度致密，而D-半乳糖組大鼠聽皮層線粒體基質(zhì)電子密度明顯降低，甚至出現(xiàn)空泡樣變性，并可見溶酶體吞噬脂滴形成脂褐素，D-半乳糖+羅布麻寧組大鼠聽皮層線粒體超微結(jié)構(gòu)相較于D-半乳糖組明顯改善（圖3）。

圖3 各實驗組大鼠聽皮層線粒體超微結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺=0.5 μm。M：線粒體；箭頭：脂褐素。Control：對照組；D-gal：D-半乳糖組；D-gal+APO：D-半乳糖+羅布麻寧組。Fig.3 The mitochondrial ultrastructure in the auditory cortex of rats in different groups.Scale bar=0.5 μm.APO,apocynin.D-gal,D-galactose.M,mitochondria.

2.4 羅布麻寧提高D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層線粒體功能

對照組、D-半乳糖組和D-半乳糖+羅布麻寧組大鼠聽皮層ATP水平分別為13.50±1.40 nmol/mg protein、6.11±1.75 nmol/mg protein和9.72±0.88 nmol/mg protein，D-半乳糖組比對照組顯著降低（F=-7.388,P＜0.01），而D-半乳糖+羅布麻寧組比D-半乳糖組則顯著升高（F=3.605,P＜0.01）（圖4A）；對照組、D-半乳糖組和D-半乳糖+羅布麻寧組大鼠聽皮層線粒體膜電位水平分別為8.13±1.18、4.41±0.48和6.47±1.06，D-半乳糖組比對照組顯著降低（F=-3.720,P＜0.01），而D-半乳糖+羅布麻寧組比D-半乳糖組則顯著升高（F=2.063,P＜0.05）（圖4B）。

圖4 （A）各實驗組大鼠聽皮層ATP水平；（B）各實驗組大鼠線粒體膜電位水平。*P＜0.05，**P＜0.01。Control：對照組；D-gal：D-半乳糖組；D-gal+APO：D-半乳糖+羅布麻寧組。Fig.4 (A)Levels of ATP in the auditory cortex of rats in different groups.(B)Levels of MMP in the auditory cortex of rats in different groups.*P＜0.05，**P＜0.01.APO,apocynin.D-gal,D-galactose.MMP,mitochondrial membrane potential.

3 討論

線粒體是機體能量代謝的場所，在能量代謝過程中，線粒體產(chǎn)生ATP的同時也產(chǎn)生活性氧[11]。由于線粒體缺乏組蛋白的保護(hù)，因此容易受到活性氧的損傷。在老化的過程中，由于機體對抗活性氧的能量減弱，導(dǎo)致線粒體氧化損傷的進(jìn)行性加重，最終引起線粒體功能障礙，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生增加[12]。先前的研究已經(jīng)證實：在D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠早期，和對照組大鼠相比較，聽力學(xué)上僅表現(xiàn)為聽性腦干反應(yīng)（auditory brain response,ABR）波幅的降低[13]，而無ABR閾值的升高[13,14]，但接受氨基糖甙類抗生素注射的D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠表現(xiàn)為更高的ABR閾值[14]；同時，D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠組織病理學(xué)上表現(xiàn)為聽覺外周[3]和聽覺中樞[4,7]線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷和線粒體DNA缺失突變的累積。上述前期研究結(jié)果充分說明：在衰老的早期階段，聽覺系統(tǒng)線粒體損傷可能不直接導(dǎo)致聽閾的明顯升高，但能增加聽覺系統(tǒng)對外界有害刺激的敏感性。本研究的結(jié)果證實：羅布麻寧可有效降低D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠中樞聽覺系統(tǒng)聽皮層組織活性氧的產(chǎn)生，提高抗氧化能力，進(jìn)而減輕線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，最終改善線粒體功能。

NADPH氧化酶是機體內(nèi)另一個活性氧的主要來源，NADPH 氧化酶和 P22phox、P47phox、P67phox等亞基結(jié)合，形成酶功能復(fù)合體，進(jìn)而產(chǎn)生活性氧[15]。NADPH氧化酶抑制劑羅布麻寧可抑制P47phox和NADPH氧化酶的結(jié)合，從而影響酶功能復(fù)合體的形成，減少活性氧的產(chǎn)生[8,9]。我們之前的研究證實NADPH氧化酶的表達(dá)在D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽覺中樞顯著增加，NADPH氧化酶相關(guān)的活性氧產(chǎn)生可導(dǎo)致聽覺中樞線粒體氧化損傷，線粒體功能明顯下降，并激活依賴線粒體的細(xì)胞凋亡途徑。因此，我們推測NADPH氧化酶的過表達(dá)可能是聽覺中樞老化的重要原因[4,7]。

羅布麻寧又稱為香草乙酮，是一種選擇性的NADPH氧化酶抑制劑。羅布麻寧作為氧清除劑，抑制P47phox亞基與位于白細(xì)胞，單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶和P22phox亞基相結(jié)合，從而降低NADPH氧化酶活性，減少活性氧的生成，減輕氧化應(yīng)激[8,9]。最新的一項研究也表明，羅布麻寧通過抑制大鼠腦缺血性損傷后活性氧的過來產(chǎn)生，減輕線粒體功能障礙和線粒體依賴的細(xì)胞凋亡，從而減輕大鼠腦缺血損傷的程度[16]。本研究證實NADPH氧化酶抑制劑羅布麻寧可有效降低D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層氧化應(yīng)激水平，提高總超氧化物岐化酶、ATP和線粒體膜電位水平。因此，羅布麻寧可對中樞聽覺系統(tǒng)老化起到干預(yù)性保護(hù)作用。