陳佩佩 李雯 左娜 吳成 胡夢茹 劉少峰*

1皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科

2上海復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉頭頸科醫(yī)院

哺乳動物Corti器的感覺毛細(xì)胞常會因疾病、年齡以及一些損傷因素缺失從而導(dǎo)致耳聾[1]，然而，不同于鳥類及一些低等動物內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷后有再生能力[2-5]，哺乳動物Corti器官上終末分化的毛細(xì)胞一旦丟失無法再生或被替換[6,7]。內(nèi)耳的發(fā)育是一個多基因參與調(diào)控的復(fù)雜的過程，其中從耳基板到毛細(xì)胞分化過程更是有著復(fù)雜的基因通路調(diào)控[8]。關(guān)于這一現(xiàn)象，目前已經(jīng)證實多種基因在這一過程中有重要作用[9]，如Sox2基因，是內(nèi)耳發(fā)育過程中所必須的[10]。但仍有更多新的基因需要進一步研究與探索。

Evi-1，又 稱 Mecom、PRDM3，PRDM3 屬 于PRDM（PRDI-BF1 and RIZ homology domain containing）蛋白質(zhì)家族中的一員，該基因家族的特征在于N-末端PR結(jié)構(gòu)域和C-末端鋅指結(jié)構(gòu)域[11]，并且該家族可以通過調(diào)節(jié)JNK和TGFβ等信號，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及組織器官的發(fā)育[12]，目前已經(jīng)證實PRDM家族可以控制癌癥中的細(xì)胞增殖[13,14]，其中Prdm16控制小鼠骨骼肌和棕色脂肪之間的轉(zhuǎn)換[15]，而hamlet決定果蠅中的神經(jīng)元類別[16]。目前已經(jīng)證明Evi-1可以通過其DNA結(jié)合域-1結(jié)合Smad3蛋白從而參與調(diào)控制TGF-β信號通路[17]，并且在先前的研究也發(fā)現(xiàn)EVi-1蛋白可以于多種蛋白相互作用，參與基因表達調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是Evi-1基因在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中是否表達，在什么位置表達以及在什么時間段表達，目前尚未有相關(guān)的報道。目前已知Sox2是干細(xì)胞的通用標(biāo)記物，廣泛表達于各種器官的胚胎和祖細(xì)胞以及發(fā)育和成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中，其在耳基板中明顯表達，是內(nèi)耳發(fā)育過程中是前感覺區(qū)的早期標(biāo)記物[18,19]。因此，本研究采用免疫熒光共標(biāo)記技術(shù)，對Sox2及Evi-1進行共染色，觀察Evi-1基因在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中的表達情況，為進一步研究其功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的獲取

挑選耳廓反應(yīng)靈敏、適齡（8-10周）的C57BL/6小鼠以雌：雄=2:1的比例作為種鼠交配（由復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉醫(yī)院實驗動物中心提供并具有合格證），于下午5點左右將雌雄鼠合籠，次日8點發(fā)現(xiàn)孕栓之日為胚胎第0.5天（E0.5）。

1.2 胎鼠內(nèi)耳的處理

分別選取E9.5至E18.5的孕鼠各2只，實驗動物統(tǒng)一在上午8點處死，從而來獲取E9.5至E18.5時期每階段各6只胎鼠。以甲苯噻嗪-氯胺酮背部皮下注射麻醉孕鼠后，迅速剖腹，取出胚胎，放入預(yù)冷的4%的多聚甲醛中（4%PFA）,對小于E15.5天的胎鼠直接斷頭后留取胎頭，對E15.5后的胎鼠直接分離內(nèi)耳；隨后將上述樣本放入4度冰箱靜置2h后，PBS沖洗3遍，隨后移入到15%的蔗糖溶液中，在4度冰箱放置約3-6h，待樣本沉底后，更換30%的蔗糖放置于4度過夜；于次日將樣本浸入OCT包埋劑中（optimal cutting temperature compound）包埋4h，顯微鏡下將小于E15天胎頭平行切片擺放，切片時平行于口-耳切片；大于E15的內(nèi)耳平行于蝸軸擺放，切片時平行于蝸軸切片；放入-20度冰箱冷凍。隨后將樣本垂直立于冰凍切片托盤上，OCT固定，片厚10uM，沿圖A橫線所示方向進行連續(xù)切片，冰凍切片保存于-20度冰箱中備用，多余的標(biāo)本及冰凍切片放入-80度箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗設(shè)備及材料

Leica DMR顯微鏡（熒光／白光），Leica CM3050S 冷凍切片機 (Leica Microsystems，瑞士)，鼠源性抗Evi-1單克隆抗體（Santa sc-130025），羊源性Sox2單克隆抗（Santa sc-17320）Alexa Fluorenc抗兔(1:400,invitrigen 1834794)；Adobe Photoshop圖像處理軟件。

1.4 免疫組織化學(xué)染色步驟

將載有標(biāo)本的冰凍切片常溫干燥1h后，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）浸泡10min，洗去OCT，98度水浴鍋進行高溫抗原修復(fù)15-20min，隨后使用1%的PBST配置的10%的胎牛血清在37度孵育1h后移入4度冰箱過夜；次日配置抗EVI-1小鼠單克隆抗體（1:300）以及抗Sox2山羊單克隆抗體（1:800）一抗，37度孵育1h后，移入4度冰箱過夜后PBS沖洗3遍，每次5min；二抗使用抗小鼠Alexa Fluor 488和Cy3-conjμgated Affini-Pure donkey Anti-Goat IgG(H+L)，室溫孵育2h（避光）后，PBS沖洗三遍，每遍5min，然后使用DAPI（1:1000）染細(xì)胞核，室溫10min；最后使用封片甘油和指甲油封片。（-20度冰箱避光保存）。PBS代替抗Evi-1小鼠單克隆抗體作為陰性對照，免疫組化無陽性顯色。（圖1 B、C）

圖1 冰凍切片方向及陰性對照。A：沿橫線所示進行連續(xù)冰凍切片；B：紅色標(biāo)記Sox2的表達；C：E11時期，以PBS代替Evi-1抗小鼠單克隆抗體作為陰性對照，免疫組化無陽性顯色Fig.1 The direction of frozen sections and negative controlA：Serial sections along the horizontal line;B：Sox2 in B are labeledinred；C：NopositiveareawasdetectedwhenPBSinstead ofEvi-1anti-mousemonoclonalantibodyasanegativecontrol.

2 結(jié)果

胎鼠冰凍切片方向按照圖1A橫線所示進行連續(xù)切片。小鼠內(nèi)耳在E9.5天時，耳基板開始內(nèi)陷并逐漸封閉形成聽泡，此時可觀察到Sox2于聽囊背外側(cè)及腹內(nèi)側(cè)均有表達（圖2A），但尚未在聽囊及其周圍間充質(zhì)觀察到Evi-1蛋白的表達（圖2B）。E10.5時期聽泡繼續(xù)發(fā)育，腹側(cè)突出逐漸形成耳蝸始基及前庭始基，此時檢測到Sox2在聽囊的側(cè)面及耳蝸囊表達（圖3A）；同時可在耳蝸囊（CS）、前庭囊（VS）以及面神經(jīng)節(jié)周圍發(fā)現(xiàn)Evi-1蛋白的表達（圖3B），其中背側(cè)表達較腹側(cè)明顯，但在感覺上皮中仍未觀察到Evi-1的表達（圖3E）；E11.5時期，前庭始基與耳蝸始基區(qū)分已經(jīng)很明顯，耳蝸始基繼續(xù)向腹側(cè)擴大，并且在前庭始基上已經(jīng)可以區(qū)分內(nèi)淋巴囊和管始基逐漸發(fā)育形成上、后半規(guī)管。E11.5時期，Sox2主要表達于前感覺區(qū)（圖4D），并且可在內(nèi)耳中整個感覺上皮的周圍間充質(zhì)見到Evi-1顯著表達（圖4E），但此時Evi-1仍然局限表達于感覺上皮周圍的間充質(zhì)中，仍未在這一時期的感覺上皮中觀察到Evi-1的表達（圖4E）；在E12.5時期，聽泡進一步發(fā)育變長，側(cè)面開始形成外半規(guī)管，腹側(cè)內(nèi)耳開始出現(xiàn)橢圓囊，Sox2表達主要分布于腹內(nèi)側(cè)的感覺上皮層（圖5D），Evi-1在內(nèi)耳周圍間充質(zhì)中仍明顯表達，同時，在感覺上皮內(nèi)的耳蝸及前庭部分均觀察到了evi-1的表達（圖5E）。但隨著內(nèi)耳繼續(xù)發(fā)育到，感覺上皮以及耳周間充質(zhì)中的Evi-1表達開始逐漸減弱直至完全消失，E13.5時期時，內(nèi)耳中已經(jīng)無法觀察到明顯的Evi-1的表達，并且內(nèi)耳周圍間充質(zhì)中的部分區(qū)域的Evi-1的表達開始逐漸減弱消失（圖6B），到E15.5時期時Evi-1在內(nèi)耳及耳周間充質(zhì)中的表達已經(jīng)完全消失，此后均未在內(nèi)耳及其周圍間充質(zhì)中觀察到Evi-1的表達（圖7B、E）。

圖2 E9.5時期，Evi-1及Sox2的表達。A-C：低倍數(shù)下觀察到的Sox2與Evi-1在內(nèi)耳中的表達分布：D：Sox2于聽囊背外側(cè)及腹內(nèi)側(cè)表達；E：尚未在內(nèi)耳中觀察到明顯的Evi-1的表達；F：為圖D和圖E的疊加；（紅色：Sox2；綠色：Evi-1）OC：聽泡。標(biāo)尺為50μmFig.2 A：The expression of Sox2 and Evi-1 at E9.5.A-C：The expression of Sox2 and Evi-1 in inner ear at low-power field：D：The expression of Sox2 has detected in dorsolateral and ventromedial of otic vesicle at E9.5；E：There was no obvious expression of Evi-1 in inner ear at this stage；F：Fig F is the stack of D and E；(Red：Sox2 Green：Evi-1)OC：otocyst.Scale bar：50μm

圖3 E10.5時期，Evi-1及Sox2的表達。A-C:低倍數(shù)下Sox2與Evi-1在內(nèi)耳中的表達分布；D：Sox2在聽囊的側(cè)面及耳蝸囊表達；E：Evi-1在耳蝸始基及前庭始基背側(cè)開始出現(xiàn)表達，并且在面神經(jīng)節(jié)周圍出現(xiàn)明顯表達，F(xiàn)：為圖D和圖E的疊加；(紅色：Sox2；綠色：Evi-1)VS：前庭囊，CS：耳蝸囊。標(biāo)尺為50μmFig.3 The expression of Sox2 and Evi-1 at E10.5.A-C：The expression of Sox2 and Evi-1 in inner ear at low-power field；D：The expression of Sox2 was observed in dorsolateral of otic vesicle and cochlear capsule.E：The expression of Evi-1 has arose in the dorsal of cochlear and vestibular primordium at E10.5.(Red：Sox2；Green：Evi-1)VS：vestibular sacs,CS：cochlear capsule.Scale bar：50μm

圖4 E11.5時期，Evi-1及Sox2的表達。A-C:低倍數(shù)下觀察到的Sox2與Evi-1在內(nèi)耳中的表達分布；D:Sox2表達主要分布于前感覺區(qū);E:E11.5時期，Evi-1在內(nèi)耳感覺上皮區(qū)周圍的間充質(zhì)中均明顯表達；F：為圖D和圖E的疊加；H-J：細(xì)胞核由DAPI標(biāo)記；(紅色：Sox2；綠色：Evi-1；藍(lán)色：DAPI)CD：蝸管，SS：上半規(guī)管，PS：后半規(guī)管 E：淋巴管 V：前庭部分。標(biāo)尺為50μmFig.4 The expression of Sox2 and Evi-1 at E11.5.A-C：The expression of Sox2 and Evi-1 in inner ear at low-power field；D：Sox2 was mainly expressed in prosensory domain;E：The expression of Evi-1 has clearly observed in mesenchyme around the Sensory epithelium in inner ear；F：Fig F is the stack of D and E；H-J：Nuclei are labeled with DAPI;(Red：Sox2；Green：Evi-1；Blue：DAPI);CD：cochlear duct,SS：superior semicircular canal,PS：posterior semicircular canal E：lymphatic V：vestibular.Scale：50μm

圖5 E12.5時期，Evi-1及Sox2的表達。A-C:低倍數(shù)下觀察到的Sox2和Evi-1的表達分布；D:Sox2表達主要分布于腹內(nèi)側(cè)的感覺上皮層；E：Evi-1在內(nèi)耳周圍間充質(zhì)中及感覺上皮中明顯表達；CL：耳蝸，LS：外半規(guī)管，UT：橢圓囊，SA：球囊標(biāo)尺為50μmFig.5 A-C：At E12.5，the expression of Sox2 and Evi-1 in inner ear at low-power field；D ：Sox2 was mainly expressed in sensory epithelium at ventromedial of inner ear；E：Evi-1 was strongly observed not only in periotic mesenchyme but also in sensory epithelium at E12.5；F：Fig F is the stack of D and E；CL：cochlea,LS：lateral semicircular canal,UT：utricle,SA：saccule.Scale：50μm

圖6 E13.5時期，Evi-1及Sox2的表達。A：E13.5時期，Sox2的表達；B：Evi-1在內(nèi)耳及其周圍間充質(zhì)中的表達逐漸減弱甚至消失；C：為圖A和圖B的疊加；(紅色：Sox2；綠色：Evi-1)Fig.6 The expression of Sox2 and Evi-1 at E13.5.A：The express of Sox2 at E13.5；B：The expression of Evi-1 gene in inner ear and it's surrounding mesenchyme has gradually weakened and even disappeared since E13.5；F：Fig F is the stack of D and E.(Red：Sox2；Green：Evi-1)Scale：50μm

圖7 E15.5及E18.5時期，Evi-1及Sox2的表達。A-F：E15.5時期，Evi-1表達完全消失，其隨后的發(fā)展階段，也未在內(nèi)耳及其周圍間充質(zhì)中觀察到Evi-1的表達。標(biāo)尺為50μmFig.7 The expression of Sox2 and Evi-1 at E13.5 and E18.5.A-F：The expression of Evi-1 has disappear completely since E15.5.Scale：50μm

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Evi-1在果蠅stage13時期開始在脊索表達，到stage21時期逐漸局限在端腦、中腦、腦室層、感覺器官聽泡周圍的間充質(zhì)[20,21]，但Evi-1在內(nèi)耳中的表達作用目前尚無相關(guān)詳細(xì)報道，本研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳的發(fā)育過程中，Evi-1在E10.5-E14.5的內(nèi)耳周圍的間充質(zhì)中呈一過性表達，E14.5時期后內(nèi)耳中Evi-1的表達逐漸減弱至消失。E9時，聽板內(nèi)陷形成聽泡，E10.5時期開始形成耳蝸始基和前庭始基，此時，毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的祖先仍在分裂，發(fā)育至E13.5,約85%將來分化為耳蝸毛細(xì)胞的感覺細(xì)胞退出細(xì)胞周期停止分裂，但此時還未發(fā)現(xiàn)毛細(xì)胞分化[9]。目前也已經(jīng)證實E12至E13小鼠耳蝸感覺細(xì)胞以增殖為主，E14至E15感覺細(xì)胞分化逐漸占優(yōu)勢[22]。這些均表明小鼠E13.5以前是耳蝸毛細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點。Evi-1在耳周間充質(zhì)的表達時間段于內(nèi)耳中毛細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵時期一致，因此，我們猜測其可能在感覺細(xì)胞的增殖分化及毛細(xì)胞的發(fā)育成熟存在一定的關(guān)系。

上皮和間充質(zhì)組織相互之間的誘導(dǎo)信號在許多系統(tǒng)的組織器官的發(fā)育過程中具有重要作用，目前已經(jīng)證明耳周間充質(zhì)的眾多信號分子[23-26]及調(diào)控基因在內(nèi)耳的早期發(fā)育及內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞增殖分化為毛細(xì)胞的過程中具有重要作用[27-30]。White等人將分離的耳蝸支持細(xì)胞與E13.5時期小鼠前庭區(qū)域的間充質(zhì)共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞[31,32]。Annikoji及劉少鋒等人均發(fā)現(xiàn)在E12.5時，耳周間充質(zhì)對感覺上皮形態(tài)發(fā)生及毛細(xì)胞的發(fā)育形成具有明顯促進作用[26]。這些均表明在E12.5這個階段與耳蝸感覺上皮相鄰的耳周間充質(zhì)內(nèi)可能含有某種物質(zhì)或某種調(diào)控或誘導(dǎo)信號，可以促進感覺前體細(xì)胞增值以及毛細(xì)胞發(fā)育。因此，我們猜測Evi-1可能在感覺上皮的分化發(fā)育以及毛細(xì)胞的發(fā)育成熟存在一定的相關(guān)性。

本研究利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察Evi-1基因在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中表達的時空變化規(guī)律，為進一步研究Evi-1與支持細(xì)胞的增殖及毛細(xì)胞分化成熟的關(guān)系提供依據(jù)。