賀璐 龔樹生 王國鵬

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(100050北京)

哺乳動物的內(nèi)耳感覺上皮分布于Corti’s器、橢圓囊斑、球囊斑和半規(guī)管的壺腹嵴中，是感受聽覺和平衡覺的重要部位。多種損傷因素可以導(dǎo)致內(nèi)耳感覺上皮不同程度的損傷，輕中度者只有毛細(xì)胞損傷，而支持細(xì)胞存活；重度者毛細(xì)胞和支持細(xì)胞都受到損傷、感覺上皮極度退化，由一層缺乏分化特點的扁平細(xì)胞所替代，稱之為“扁平上皮”[1]。目前關(guān)于內(nèi)耳感覺上皮損傷與修復(fù)的研究多集中于輕中度損傷。已有多項研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳感覺上皮受到重度損傷后呈現(xiàn)為扁平上皮[2-4]，且重度聽力損失和/或前庭功能障礙的患者內(nèi)耳感覺上皮演變?yōu)楸馄缴掀さ默F(xiàn)象也并不少見[5-7]。因此，針對內(nèi)耳扁平上皮的病理特點、形成機(jī)制及干預(yù)的深入研究對于防治重度聽力損失和前庭功能障礙具有重要意義。本文將對內(nèi)耳扁平上皮的病因、特點、形成機(jī)制和干預(yù)研究進(jìn)展展開綜述。

1 內(nèi)耳扁平上皮形成的成因

內(nèi)耳感覺上皮對多種損傷因素敏感，這些損傷因素可直接作用于毛細(xì)胞，亦或作用于支持細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Spiral ganglion neurons,SGNs）[8]。感覺上皮損傷導(dǎo)致內(nèi)耳扁平上皮形成的常見因素有：

1.1 耳毒性藥物：在多個哺乳動物模型中都觀察到大劑量耳毒性藥物損傷后導(dǎo)致內(nèi)耳扁平上皮的形成：Raphael等[2]報道豚鼠注射大劑量新霉素后第4天耳蝸即出現(xiàn)扁平上皮。Coco等[9]在大劑量卡那霉素和利尿酸致聾的貓耳蝸中觀察到底回的毛細(xì)胞消失，形成扁平上皮。Taylor等[3]報道C57小鼠卡那霉素和布美他尼損傷后第4周耳蝸局部扁平上皮形成。

1.2 遺傳因素：縫隙連接蛋白26（Connexin26,Cx26）表達(dá)異常是非綜合征型遺傳性耳聾的主要原因之一，Sun等[10]發(fā)現(xiàn)不表達(dá)Cx26的小鼠生后1月耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞全部丟失，形成扁平上皮。Pcdh15基因突變與綜合征型（Usher’s綜合征I型）和非綜合征型耳聾（DFNB23）相關(guān)，Pcdh15基因敲除小鼠可出現(xiàn)耳蝸感覺上皮扁平化[4]。此外部分Usher I型綜合征和常染色體顯性遺傳性耳蝸發(fā)育不良患者可出現(xiàn)Corti’s器感覺上皮完全消失，代之以扁平上皮組織[6]。

1.3 噪聲：Cotanche等[11]發(fā)現(xiàn)，純音噪聲（123dB）暴露后的雞內(nèi)耳聽覺上皮被扁平上皮替代。在鼠中同樣發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重噪聲暴露后Corti’s器消失，基底膜被扁平上皮覆蓋[12]。

除此之外，梅尼埃病[5]、內(nèi)耳感染[7]等也可能是內(nèi)耳扁平上皮形成的原因。

2 內(nèi)耳扁平上皮的特點

2.1 組織結(jié)構(gòu)：扁平上皮由一層菲薄的上皮細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞的大小形態(tài)不一[2]，表面被覆微絨毛[13]。此類細(xì)胞核大于正常細(xì)胞核，細(xì)胞器稀少。組織結(jié)構(gòu)有時可呈現(xiàn)極性，形成放射狀形態(tài)[3]。

2.2 細(xì)胞特性

2.2.1 保留細(xì)胞間連接：扁平上皮細(xì)胞頂端存在緊密連接蛋白ZO-1[2]及縫隙連接蛋白Cx26和Cx30[3]。在正常哺乳動物內(nèi)耳中，ZO-1主要分布于耳蝸表皮板內(nèi)外毛細(xì)胞和與之相連的支持細(xì)胞之間，是構(gòu)成內(nèi)外淋巴屏障的重要組成部分。Cx26主要表達(dá)于耳蝸基底膜的深面和耳蝸外側(cè)壁，參與內(nèi)外淋巴液的離子轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。扁平上皮中保留細(xì)胞間連接表明即使內(nèi)耳感覺上皮極度退化，扁平上皮可能仍保留維持內(nèi)外淋巴屏障完整和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，進(jìn)而維持內(nèi)外淋巴電位穩(wěn)定。

2.2.2 高細(xì)胞代謝水平：蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）在糖代謝、細(xì)胞分化控制、基因表達(dá)調(diào)控、長時程抑制等過程中發(fā)揮重要作用。Ladrech等[15]發(fā)現(xiàn)在耳蝸損傷后的扁平上皮組織中，所有的細(xì)胞都高表達(dá)PKC，提示扁平上皮細(xì)胞可能具有較高的代謝活性。

2.2.3 高有絲分裂水平：Raphael等[2]在豚鼠耳蝸扁平上皮形成早期觀察到活躍的有絲分裂現(xiàn)象，細(xì)胞周期抑制因子p27kip1也與有絲分裂程度同步變化。上皮細(xì)胞的有絲分裂有助于上皮屏障的快速形成。

2.2.4 再生潛能：Wang等[13]報道小鼠橢圓囊感覺上皮損傷后1個月形成的扁平上皮中具有同時表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)記物Myosin VIIa和表達(dá)Sox2的細(xì)胞，且細(xì)胞表面在損傷后3個月出現(xiàn)幼稚的纖毛，細(xì)胞形態(tài)類似II型毛細(xì)胞。

2.3 神經(jīng)支配的變化：Izumikawa等[16]和Shibata等[17]發(fā)現(xiàn)，耳蝸扁平上皮中神經(jīng)纖維出現(xiàn)回縮,SGNs的數(shù)目也明顯減少，神經(jīng)元胞體較正常縮小。但在前庭扁平上皮中，神經(jīng)纖維和神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)為遲發(fā)性退化[13]。人類扁平上皮的神經(jīng)退化過程可能更加漫長：人類耳蝸扁平上皮標(biāo)本中SGNs的數(shù)量減少，但并不會完全消失[6]。人類前庭終器退化為扁平上皮數(shù)年后神經(jīng)盞和神經(jīng)纖維的形態(tài)仍可基本維持正常[5]。

3 內(nèi)耳扁平上皮的形成機(jī)制

3.1 非哺乳動物內(nèi)耳扁平上皮的形成機(jī)制

鳥類等非哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷后具有自我修復(fù)的特性。感覺上皮受到重度損傷后，毛細(xì)胞和支持細(xì)胞均消失。傷后早期，位于基底乳頭（即毛細(xì)胞和支持細(xì)胞所在區(qū)域）邊緣的透明細(xì)胞或立方細(xì)胞遷移至感覺上皮區(qū)域，形成扁平上皮，繼而分裂、分化為成熟的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞[18]。

3.2 哺乳動物內(nèi)耳扁平上皮的形成機(jī)制

哺乳動物內(nèi)耳扁平上皮的形成機(jī)制目前尚不明確，其內(nèi)耳感覺上皮受損后有可能經(jīng)歷以下一個或幾個階段[19]：

3.2.1 瘢痕形成：耳蝸毛細(xì)胞丟失后，周圍的Deiters細(xì)胞和Pillar細(xì)胞頂端擴(kuò)張，在表皮板封閉毛細(xì)胞丟失遺留的空缺，形成“瘢痕”。相似的過程也發(fā)生在前庭感覺上皮損傷修復(fù)的過程中：前庭毛細(xì)胞受損后，線粒體崩解，纖毛融合甚至消失，嚴(yán)重者毛細(xì)胞死亡，而前庭感覺上皮中的支持細(xì)胞存活，并參與毛細(xì)胞殘骸的清除。有報道前庭毛細(xì)胞損傷后其周圍支持細(xì)胞形成瘢痕結(jié)構(gòu)填充原毛細(xì)胞所在的位置[20]。瘢痕的形成維持了內(nèi)耳感覺上皮結(jié)構(gòu)的完整，減少內(nèi)外淋巴電位發(fā)生波動，避免毛細(xì)胞和神經(jīng)突觸的進(jìn)一步損傷。瘢痕形成是輕中度損傷情況下的病理變化，當(dāng)損傷程度較重時，內(nèi)耳感覺上皮的形態(tài)將繼續(xù)發(fā)生以下變化。

3.2.2 感覺上皮重組：Ladrech等[15]在大鼠耳蝸感覺上皮受損后的不同時間點進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在瘢痕形成以后，耳蝸外螺旋溝處的上皮細(xì)胞和部分間質(zhì)細(xì)胞向內(nèi)側(cè)遷移覆蓋感覺上皮受損形成的瘢痕。這些遷移細(xì)胞的上皮標(biāo)記物E-cadherin和Laminin表達(dá)降低，并表達(dá)間葉標(biāo)志物Vimentin，提示這些細(xì)胞可能通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（Epithelial–mesenchymal transition，EMT）獲得了間葉細(xì)胞的某些特性。EMT在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織再生與修復(fù)等過程中扮演重要角色，它能夠增強(qiáng)細(xì)胞的分化潛能、遷徙和凋亡能力[21]。

3.2.3 扁平上皮形成：是內(nèi)耳感覺上皮退化的最終結(jié)果，有關(guān)扁平上皮的細(xì)胞來源目前還所知甚少，主要有以下兩個可能（圖1）：①原有感覺上皮的支持細(xì)胞（Deiter細(xì)胞、Pillar細(xì)胞、Hensen細(xì)胞、Phalangeal細(xì)胞、前庭支持細(xì)胞）去分化。盡管目前沒有直接的證據(jù)，但在前庭扁平上皮中觀察到某些細(xì)胞具有支持細(xì)胞的特性（表達(dá)支持細(xì)胞的標(biāo)記物Sox2，但不表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)記物Myosin VIIa），表明這些扁平細(xì)胞有可能是去分化的支持細(xì)胞[13]。②原有支持細(xì)胞死亡，周圍的細(xì)胞遷移、分裂形成。在耳蝸感覺上皮重組的階段中，Tectal細(xì)胞、Hensen細(xì)胞等Corti’s器外側(cè)的細(xì)胞向內(nèi)遷移覆蓋疤痕結(jié)構(gòu)，同時扁平上皮細(xì)胞的某些性質(zhì)也與這些細(xì)胞相似，比如高表達(dá)Cx26和Cx30，不表達(dá)Cx43、乙?；⒐艿鞍?、KCC4等標(biāo)記物，細(xì)胞外側(cè)壁存在大的縫隙連接等[15]。在部分扁平化的基底膜中觀察到，疤痕部位的細(xì)胞保留支持細(xì)胞的特點，但疤痕部位和扁平上皮區(qū)域之間不存在過渡形態(tài)的細(xì)胞，且扁平上皮區(qū)域的細(xì)胞核數(shù)量與疤痕部位的細(xì)胞核數(shù)量相比明顯減少，提示在扁平上皮形成的過程中部分支持細(xì)胞可能死亡。支持細(xì)胞在何種情況下會被損傷從而導(dǎo)致扁平上皮的形成，原因并不清楚。在同一個受損的耳蝸中，可能并非所有部位都是扁平上皮[2]，甚至在同一個部位，也可以出現(xiàn)僅一小片組織為扁平上皮的情況[3]。在未來的研究中，利用細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)特異性標(biāo)記內(nèi)耳感覺上皮特定的細(xì)胞類型或許可以揭示扁平上皮的形成機(jī)制。

圖1 哺乳動物前庭扁平上皮形成的可能機(jī)制Fig.1 The potential mechanisms of mammalian vestibular flat epithelium formation

4 干預(yù)研究

目前對于扁平上皮的性質(zhì)和發(fā)病機(jī)制還沒有完全闡明，扁平上皮中的很多細(xì)胞已經(jīng)失去了原有毛細(xì)胞或者支持細(xì)胞的特性，這些因素使得對內(nèi)耳“重度損傷”引起的扁平上皮進(jìn)行干預(yù)較“輕中度損傷”時更為棘手。

4.1 基因治療

內(nèi)耳基因治療研究已有20余年的歷史，通過特定的途徑將攜帶目的基因的載體導(dǎo)入內(nèi)耳，進(jìn)行基因的修飾和表達(dá)，能夠起到特定的治療作用[19,22,23]。堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Atoh1是調(diào)控毛細(xì)胞發(fā)育分化的最重要的調(diào)控因子之一。外源性過表達(dá)Atoh1可以促使支持細(xì)胞分化為毛細(xì)胞[24,25]，然而在耳蝸扁平上皮中過表達(dá)Atoh1卻并沒有出現(xiàn)毛細(xì)胞的誘導(dǎo)再生[16]，提示表達(dá)Atoh1的細(xì)胞是否能夠轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞與該細(xì)胞的性質(zhì)有關(guān)。多信號通路的聯(lián)合調(diào)控來誘導(dǎo)重度損傷后毛細(xì)胞的再生是未來研究方向之一。

4.2 干細(xì)胞治療

對于支持細(xì)胞缺失、組織形態(tài)退化的扁平上皮來說，干細(xì)胞治療是一種值得考慮的選擇。干細(xì)胞具有自我更新能力并可分化為多種類型的細(xì)胞，目前已經(jīng)能夠使干細(xì)胞在體外成功的分化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞，但其在內(nèi)耳扁平上皮中分化為成熟的毛細(xì)胞面臨著以下幾個困難：①外源性的干細(xì)胞無法適應(yīng)內(nèi)淋巴液的高鉀離子環(huán)境，將導(dǎo)致細(xì)胞迅速死亡[26]；②扁平上皮頂端的緊密連接不利于干細(xì)胞的定植；③分化成具有功能的毛細(xì)胞可能需要一系列復(fù)雜的調(diào)控過程。

4.3 神經(jīng)支配的保護(hù)策略

重度耳聾和前庭功能障礙患者的內(nèi)耳病理可表現(xiàn)為扁平上皮，由于這部分患者是人工耳蝸或前庭植入的潛在對象[27,28]，而植入體能夠有效工作的前提是內(nèi)耳有足夠數(shù)量的神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)纖維，因此，感覺上皮損傷后神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的保存對于發(fā)揮人工耳蝸或人工前庭的功能至關(guān)重要。在耳蝸損傷后的扁平上皮中，通過中階和鼓階病毒轉(zhuǎn)染扁平上皮和間質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)基因過表達(dá)的方式，促進(jìn)神經(jīng)纖維再生是扁平上皮中保存神經(jīng)支配或誘導(dǎo)神經(jīng)再生的潛在方法[29,30]。

5 總結(jié)與展望

哺乳動物內(nèi)耳扁平上皮是感覺上皮受到重度損傷后形成的一種病理狀態(tài)，可見于因耳毒性藥物、噪聲、遺傳等各種因素導(dǎo)致的重度耳聾和/或前庭功能障礙的人類或其他動物的內(nèi)耳標(biāo)本中。目前已知扁平上皮細(xì)胞分化水平較低，神經(jīng)支配存在不同程度的退化，但在上皮形成的某些階段可能具有較高的代謝水平和有絲分裂水平。耳蝸扁平上皮不能夠再生，但前庭扁平上皮可能有微弱的毛細(xì)胞再生能力。扁平上皮的形成過程中觀察到了多種蛋白標(biāo)記物的變化，對其基因表達(dá)變化的研究將有助于深入了解扁平上皮特點和形成機(jī)制。如何通過基因調(diào)控或干細(xì)胞定植分化使扁平上皮再生出具有功能的毛細(xì)胞還有待未來的研究去解決。