孫玉 張洪海 陳德喜 魏飛力 郭向華 石英

[摘要] 目的 研究乙肝表面抗原（HBsAg）+/乙肝表面抗體（HBsAb）+慢性乙型肝炎（CHB）患者S區(qū)基因突變情況。 方法 選取2012年6月～2017年10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性的CHB患者32例為研究對(duì)象（HBsAg+/HBsAb+組），隨機(jī)選取在同一時(shí)期我院診斷為HBsAg+和HBsAb-的CHB患者79例作為對(duì)照（HBsAg+/HBsAb-組）。分離其血漿病毒DNA，PCR擴(kuò)增S區(qū)基因，測(cè)序分析其突變情況。 結(jié)果 HBsAg+/HBsAb+組患者全部存在S區(qū)突變（100%），其頻率顯著高于HBsAg+/HBsAb-組（84.81%）（P < 0.05），而且突變多集中在S區(qū)亞單位1和3區(qū)域;HBsAg+/HBsAb+組S區(qū)多重位點(diǎn)突變的比例顯著高于HBsAg+/HBsAb-組（P < 0.01）。 結(jié)論 S區(qū)基因突變頻率的增加以及多重突變的存在與CHB患者S抗原抗體的變化密切相關(guān)，而這一突變的累積預(yù)示著不良的疾病進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞] 慢性乙型肝炎;乙肝表面抗原;乙肝表面抗體;S基因;突變

[中圖分類號(hào)] R575.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（b）-0118-04

[Abstract] Objective To study the S region gene mutation in patients with hepatitis B surface antigen （HBsAg） +/ hepatitis B surface antibody （HBsAb） + chronic hepatitis B （CHB）. Methods From June 2012 to October 2017， 32 cases of CHB patients with double positive HBsAg and HBsAb in Beijing You′an Hospital， Capital Medical University （hereinafter referred to as “our hospital”） were selected as subjects （HBsAg+/HBsAb+ group），79 cases of CHB patients diagnosed with HBsAg+ and HBsAb- in our hospital in the same period were randomly selected as the control group （HBsAg+/HBsAb- group）. The plasma viral DNA was isolated， the S region gene was amplified by PCR， and the mutation was analyzed by sequencing. Results All patients in the HBsAg+/HBsAb+ group had S-region mutation （100%）， and the frequency was significantly higher than that in the HBsAg+/HBsAb- group （84.81%） （P < 0.05）. Moreover， the mutations were mostly concentrated in the subunits 1 and 3 of S region. The proportion of multiple site mutations in S region in HBsAg+/HBsAb+ group was significantly higher than that in HBsAg+/HBsAb- group （P < 0.01）. Conclusion The increased frequency of S region gene mutation and the presence of multiple mutations are closely related to the change of S antigen antibody in CHB patients， and the accumulation of this mutation indicates an adverse disease process.

[Key words] Chronic hepatitis B; HBV surface antigen; HBV surface antibody; S gene; Mutation

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）呈全世界流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2017年全球肝炎報(bào)告》顯示，全球約有3.25億人染有慢性乙肝病毒或丙肝病毒，其中2.57億人感染有乙肝病毒[1]，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝硬化和肝癌[2]。我國(guó)是乙型肝炎大國(guó)，據(jù)推算，我國(guó)目前仍有HBsAg陽(yáng)性者約7000萬(wàn)，乙型肝炎患者2000萬(wàn)～3000萬(wàn)，肝硬化患者約100萬(wàn)，原發(fā)性肝癌患者約30萬(wàn)[3]。

在病毒感染過(guò)程中，抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)于清除HBV病毒顆粒，清除感染病毒的肝細(xì)胞起重要的作用。HBsAg在血清中出現(xiàn)，是乙肝病毒感染的標(biāo)志，而HBs抗體的出現(xiàn)被認(rèn)為是血清學(xué)治愈的標(biāo)志[4]。然而有報(bào)道稱臨床上有10%～25%的慢性乙肝患者同時(shí)存在HBsAg和HBsAb[5-6]陽(yáng)性，出現(xiàn)這一現(xiàn)象有宿主免疫因素和病毒因素兩個(gè)方面，其原因尚不清楚[7-9]。病毒方面可能的機(jī)制是病毒發(fā)生了選擇性的免疫逃逸突變[10]。本研究選取了32例HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性的慢性乙型肝炎（CHB）患者，另選取HBsAg+和HBsAb-的CHB患者79例作為對(duì)照，分析其S區(qū)突變特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年6月～2017年10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性的CHB患者32例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年版）[11]。HBsAg+/HBsAb+組具體入組標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者間隔至少6個(gè)月，連續(xù)2次檢查確定HBsAg與HBsAb同時(shí)陽(yáng)性;②所有患者抗-HAV、HCV、HDV、HEV、HIV抗體均為陰性，且不合并藥物性肝損害、自身免疫性肝病、酒精性肝病病史;③所有患者腹部超聲、腹部強(qiáng)化CT、腹部強(qiáng)化MRI等影像學(xué)檢查或肝組織病理學(xué)檢查均未提示肝硬化及原發(fā)性肝癌。隨機(jī)選取同一時(shí)期我院診斷為HBsAg+和HBsAb-的慢性乙型肝炎患者79例作為對(duì)照（HBsAg+/HBsAb-組）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，均經(jīng)患者知情同意。

1.2 血清免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)和HBV DNA定量檢測(cè)

采集所有受檢者清晨空腹外周靜脈血5 mL，收集上層血清（所有結(jié)果均經(jīng)過(guò)復(fù)檢），標(biāo)本放置于-80℃冰箱保存。HBsAg和HBsAb應(yīng)用羅氏公司Elecsys HBsAg/HBsAb Ⅱ定量試劑檢測(cè)，所用設(shè)備為羅氏公司Cobas定量檢測(cè)儀。血清HBV DNA定量檢測(cè)應(yīng)用美國(guó)通用公司7500實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。其他臨床檢測(cè)指標(biāo)由我院檢驗(yàn)科完成。

1.3 S區(qū)突變檢測(cè)

應(yīng)用全血DNA分離試劑盒（DNeasy Blood and Tissue Kit，Qiagen，Germany）從200 μL全血中提取基因組DNA，按照試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行操作。利用巢式PCR擴(kuò)增HBV S區(qū)，PCR引物如下：外側(cè)引物HBVS1F（5′-TTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3′），HBS1R（5′-TG-CTAGGAGTTCCGCAGTATG-3′），內(nèi)側(cè)引物HBS2F（5′-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3′），HBVS2R（5′-GCAA-AGCCCAAAAGACCCAC-3′）。PCR反應(yīng)體系：50 μL PCR反應(yīng)體系中加入5 μL 10×擴(kuò)增緩沖液，dNTP（2.5 mmol/L）5 μL，引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，加水至總體積50 μL。PCR條件如下：94℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共33個(gè)循環(huán)。第二輪PCR反應(yīng)體系、條件相同。PCR產(chǎn)物直接送公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由北京博邁德公司完成。為了進(jìn)一步分析S區(qū)突變，參考既往文獻(xiàn)[8]，將S區(qū)的主要功能單位MHR（主蛋白抗原主要親水區(qū)）區(qū)分為4個(gè)亞單位，即亞單位1（Subregion 1，氨基酸殘基100～120），亞單位2（Subregion 2，氨基酸殘基121～123），亞單位3（Subregion 3，氨基酸殘基124～137），亞單位4（Subregion 4，氨基酸殘基138～147），亞單位5 （Subregion 5，氨基酸殘基148～169），而“a”決定區(qū)為氨基酸殘基124～147區(qū)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組獨(dú)立樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CHB患者臨床資料比較

兩組在年齡、性別、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、HBsAg水平方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。兩組患者HBeAg和HBeAb的陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。HBsAg+/HBsAb+組HBV DNA、HBsAb水平顯著高于HBsAg+/HBsAb-組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組CHB患者主要位點(diǎn)突變頻率分析

HBsAg+/HBsAb+組患者均存在S區(qū)的突變，總突變率為100%，HBsAg+/HBsAb-組有67例患者存在S區(qū)突變，總突變率為84.81%（67/79），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。將兩組患者所有突變氨基酸位點(diǎn)的突變頻率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示HBsAg+/HBsAb+組患者氨基酸位點(diǎn)突變集中于Y100～R160等11個(gè)氨基酸位點(diǎn)，而HBsAg+/HBsAb-組患者氨基酸位點(diǎn)突變相對(duì)比較分散，分布于整個(gè)S區(qū)（圖1）。將HBsAg+/HBsAb+組患者的11個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)與HBsAg+/HBsAb-組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，HBsAg+/HBsAb+組患者Q101、I126位點(diǎn)的突變頻率均高于HBsAg+/HBsAb-組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 兩組患者M(jìn)HR主要功能區(qū)突變分布及百分比比較

將S區(qū)的主要功能單位MHR進(jìn)一步區(qū)分為4個(gè)亞單位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于HBsAg+/HBsAb-組，HBsAg+/HBsAb+組患者，其突變主要集中在亞單位1和3區(qū)，兩組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。HBsAg+/HBsAb+組患者“a”決定區(qū)突變頻率高于HBsAg+/HBsAb-組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表3。

HBsAg+/HBsAb+組患者中，93.75%（30/32）的患者存在2個(gè)以上突變位點(diǎn)的多重突變，HBsAg+/HBsAb-組僅有41.77%（33/79）的患者具有2個(gè)以上的多重突變，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。HBsAg+/HBsAb+組中有2例患者僅存在單位點(diǎn)S區(qū)氨基酸突變，而HBsAg+/HBsAb-組中有34例患者僅存在單位點(diǎn)S區(qū)氨基酸突變，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），且HBsAg+/HBsAb-組中有12例患者不存在S區(qū)突變。見(jiàn)圖2。

HBsAg：乙型肝炎病毒表面抗原;HBsAb：乙型肝炎病毒表面抗體;CHB：慢性乙型肝炎

3 討論

HBV S基因的突變能夠幫助病毒逃避中和抗體和疫苗的保護(hù)[12]，而S基因的變異亦對(duì)疾病的進(jìn)展產(chǎn)生不利的影響，與HBV相關(guān)的多數(shù)中晚期的肝臟疾病有關(guān)[13]。HBsAg+/HBsAb+患者是一組比較特殊的人群，深入研究其分子機(jī)制，對(duì)于全面認(rèn)識(shí)慢性乙型肝炎的自然史，了解其免疫應(yīng)答狀態(tài)等都具有深遠(yuǎn)的意義。

本研究選取了32例HBsAg+/HBsAb+CHB患者，進(jìn)行S區(qū)基因的測(cè)序，為了避免基因型對(duì)于病毒序列的影響，該32例患者經(jīng)檢測(cè)分析均為C1型HBV感染。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的32例患者均存在S區(qū)基因突變，這些患者一般臨床資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但血漿HBV DNA水平則高于HBsAg+/HBsAb-組，這也進(jìn)一步預(yù)示著該組患者擁有著不良的預(yù)后。在32例患者中，其中2例患者曾經(jīng)接受過(guò)HBV亞單位疫苗的注射。而這兩名患者的HBsAb抗體滴度均相對(duì)較低，分別為14.35 U/L和43.27 U/L。結(jié)果提示，HBV疫苗的注射對(duì)于HBV感染的意義及其具體機(jī)制有待于更為深入的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)HBsAg+/HBsAb+組患者總體突變率顯著高于HBsAg+/HBsAb-組。與以往報(bào)道[14-15]不同的是，諸多被發(fā)現(xiàn)與免疫逃逸有關(guān)的重要點(diǎn)突變，在本研究的兩組人群中比較差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究發(fā)現(xiàn)Q101、I126位點(diǎn)的突變頻率在兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示出現(xiàn)這幾個(gè)位點(diǎn)的突變可能與患者血清中出現(xiàn)S抗原和抗體雙陽(yáng)性有關(guān)。而歐美研究較多的G145R突變?cè)诒救后w中突變率較低[16]，這可能與歐美HBV亞型主要為A2亞型，而本研究中所有患者均為C亞型相關(guān)[17]。在進(jìn)一步對(duì)S區(qū)進(jìn)行分區(qū)的研究中發(fā)現(xiàn)，HBsAg+/HBsAb+組S區(qū)不同功能單位的突變情況與HBsAg+/HBsAb-組亦具有顯著的差別，因此，除了單獨(dú)研究幾個(gè)重要位點(diǎn)的突變以外，對(duì)于眾多突變位點(diǎn)突變之間的聯(lián)系亦不容忽視。本研究還發(fā)現(xiàn)，HBsAg+/HBsAb+患者均存在著多重位點(diǎn)的同時(shí)突變，這也進(jìn)一步說(shuō)明了，積累的多位點(diǎn)突變對(duì)于病毒的致病以及機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)具有重要意義[18-19]。

HBsAg+/HBsAb+CHB患者十分少見(jiàn)，但究竟抗原抗體同時(shí)存在的狀態(tài)對(duì)于疾病的恢復(fù)是有利還是有弊，至今還存在爭(zhēng)議。如能收集更多的臨床資料，對(duì)于這類患者進(jìn)行跟蹤隨訪，密切關(guān)注其免疫指標(biāo)及病毒學(xué)指標(biāo)變化的趨勢(shì)，將大大有利于這方面機(jī)制的研究。

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（收稿日期：2018-06-08? 本文編輯：封? ?華）