庫爾班江·阿布力克木 許盛飛 曾瑾 袁曉奕

膀胱過度活動(dòng)癥(overactive bladder， OAB)是臨床常見的排尿功能障礙性疾病，對(duì)患者的工作和生活均造成嚴(yán)重影響，隨著年齡的增長其發(fā)病率逐漸提高[1]。對(duì)于OAB的治療目前尚無法取得滿意效果[2]。嘌呤受體P2X3是一種ATP門控的離子通道蛋白，近年來研究證實(shí)P2X3在膀胱充盈感覺和痛覺的產(chǎn)生和易化過程中發(fā)揮核心作用[3-4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)女性原發(fā)性O(shè)AB患者其膀胱敏感性與膀胱內(nèi)P2X3表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性[5]，另有研究顯示OAB患者膀胱內(nèi)某些可能與P2X3相關(guān)的microRNAs(miRNAs)出現(xiàn)異常表達(dá)[6]，因此推測(cè)靶向P2X3的miRNAs表達(dá)異常是致敏膀胱導(dǎo)致OAB的重要致病原因。本研究對(duì)靶向P2X3的miRNAs進(jìn)行了系統(tǒng)篩選和鑒定，旨在尋找新的診斷OAB的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人胚腎293TN細(xì)胞系，DMEM 培養(yǎng)液，10%胎牛血清，感受態(tài)大腸桿菌 TOP10，熒光素酶檢測(cè)試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，P2X3 一抗。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.利用在線miRNA數(shù)據(jù)庫/預(yù)測(cè)軟件TargetScan、miRDB、miRanda、PicTar、RNA22、miRWalk、PITA在線查詢P2X3 3′端非編碼區(qū)(3′untranslated region， 3′UTR)序列的靶向miRNA。

2.雙熒光素酶報(bào)告基因P2X3 3′UTR質(zhì)粒的構(gòu)建和提取：從基因文庫中鉤取P2X3序列全長，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增P2X3 3′UTR全長，構(gòu)建psiCHECK2-P2X3 3′UTR載體質(zhì)粒。將構(gòu)建的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒。

3.雙熒光素酶報(bào)告基因載體與 miRNA mimics/陰性對(duì)照(NC)共轉(zhuǎn)染 293TN細(xì)胞：將生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的miRNA分別同psiCHECK2-P2X3 3′UTR雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞，并測(cè)定Firefly熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性，以Firefly 熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算Renilla/Firefly比值(相對(duì)熒光素酶活性)。以轉(zhuǎn)染的miR-NC為1校正各比值，以此判斷預(yù)測(cè)的miRNA是否與P2X3 3′UTR序列結(jié)合。各轉(zhuǎn)染miRNA的熒光素酶結(jié)果同miR-NC比較。

4.將篩選得到的miRNAs mimics轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)P2X3轉(zhuǎn)錄后水平的變化，進(jìn)一步篩選能夠靶向調(diào)控P2X3的miRNAs，選取Tubulin為內(nèi)參。

5.突變體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：以已構(gòu)建的 psiCHECK2-P2X3 3′UTR 質(zhì)粒為基礎(chǔ)，按照其與不同 miRNA 結(jié)合的種子序列，設(shè)計(jì)點(diǎn)突變的 mutant位點(diǎn)，構(gòu)建突變體載體質(zhì)粒。按前述實(shí)驗(yàn)步驟，將構(gòu)建的突變體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒。再按前述實(shí)驗(yàn)步驟，將突變體載體質(zhì)粒與相應(yīng)的miRNA mimics/NC共轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng) 48 h后，檢測(cè)熒光素酶活性，以最終確定特異性靶向結(jié)合P2X3 3′UTR的miRNAs。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本均值間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、生物信息學(xué)軟件對(duì)靶向結(jié)合P2X3的miRNAs的預(yù)測(cè)分析

分析結(jié)果表明有多達(dá)21種miRNA可能與P2X3結(jié)合。見圖1。

二、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證及轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞后P2X3的表達(dá)

驗(yàn)證結(jié)果表明，有3種miRNAs(hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291)能顯著下調(diào)報(bào)告基因的表達(dá)。在293TN細(xì)胞中過表達(dá)上述3種miRNAs后，P2X3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，證實(shí)這3種miRNAs可能靶向調(diào)控P2X3。見圖2。

圖2 過表達(dá)3種miRNAs后293TN細(xì)胞中P2X3蛋白的表達(dá)

三、特異性靶向結(jié)合P2X3 3′UTR的miRNAs的進(jìn)一步驗(yàn)證

構(gòu)建相應(yīng)的P2X3 3′UTR突變體的雙熒光素酶報(bào)告載體，再次進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)，最終確定特異性靶向結(jié)合P2X3 3′UTR的miRNAs共3種，為hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291。

討 論

嘌呤受體P2X是一組ATP門控的跨膜離子通道，由3個(gè)同源或異源的P2X亞基聚合而成。迄今發(fā)現(xiàn)的7個(gè)P2X(P2X1～7)亞基同源性約35%～50%，由大約400～600個(gè)氨基酸殘基組成，其C末端和N末端均位于細(xì)胞內(nèi)，其余部分組成糖基化的胞外域，構(gòu)成蛋白質(zhì)的功能區(qū)。P2X3受體是由同源聚合體(P2X3)或異源聚合體(P2X2/3)組成的寡聚體，在正常生理?xiàng)l件下特異性地表達(dá)于外周感覺神經(jīng)元、中間神經(jīng)元和體內(nèi)空腔臟器的上皮組織。研究顯示敲除P2X3基因的大鼠對(duì)外周和膀胱刺激導(dǎo)致的痛覺反應(yīng)及排尿反射明顯減弱，表明P2X3在外周痛覺反射和膀胱容量反射的傳入通路中扮演著極其重要的角色[7]。OAB動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，膀胱內(nèi)H+和表皮生長因子等細(xì)胞因子濃度的升高可增強(qiáng)P2X3途徑的信號(hào)傳遞，導(dǎo)致感覺神經(jīng)纖維激活，誘發(fā)膀胱逼尿肌過度活動(dòng)；P2X3受體又可以信號(hào)內(nèi)吞體的形式逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體，調(diào)節(jié)胞體中轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的磷酸化水平，進(jìn)一步提升神經(jīng)纖維的興奮性，同時(shí)致敏的神經(jīng)纖維還可通過上調(diào)脊髓內(nèi)突觸前P2X3受體的表達(dá)水平來進(jìn)一步放大上行性的傷害感受從而加重OAB癥狀[8]。由此可見，P2X3在膀胱充盈感覺和痛覺的產(chǎn)生、易化過程中發(fā)揮著核心作用。我們之前的研究同樣發(fā)現(xiàn)膀胱敏感性升高是女性原發(fā)性O(shè)AB發(fā)病的重要致病因素，且與膀胱黏膜內(nèi)P2X3的表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性[5]，提示P2X3過表達(dá)引起的膀胱過敏可能是導(dǎo)致原發(fā)性O(shè)AB發(fā)生的重要致病原因。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA也可靶向調(diào)控P2X分子，如miR-150在肺泡細(xì)胞內(nèi)靶向調(diào)控P2X7，miR-186和miR-150在上皮性腫瘤(包括宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、乳腺癌)中靶向調(diào)控P2X7[9-10]。P2X3能否被miRNA調(diào)控，目前還沒有任何相關(guān)報(bào)道。有報(bào)道顯示Dicer酶缺乏的轉(zhuǎn)基因大鼠的膀胱被誘導(dǎo)致敏后，膀胱內(nèi)P2X1和P2X3表達(dá)顯著升高，同時(shí)有若干相關(guān)miRNAs表達(dá)異常[6]，提示miRNA極有可能對(duì)P2X3具有靶向調(diào)控作用。

目前系統(tǒng)研究靶向單個(gè)基因miRNAs的方法的相關(guān)報(bào)道不多，根據(jù)其核心實(shí)驗(yàn)方法的不同大致可分為兩類：一種稱為蛋白裂解芯片技術(shù)(lysate microarray， LMA)，主要是基于過表達(dá)miRNAs后目標(biāo)蛋白水平的變化；另一種研究主要基于miRNA特異結(jié)合的靶基因3′UTR熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。以上兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，基于LMA的方法對(duì)生物信息學(xué)分析依賴程度較低，由于不同的生物信息學(xué)分析軟件基于的算法和數(shù)據(jù)庫差異較大，可能對(duì)最終的篩選結(jié)果造成影響，因此LMA的準(zhǔn)確率更高，但是該方法對(duì)儀器和操作以及實(shí)驗(yàn)成本要求較高，對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)室來說，難以開展；后者雖然對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求不高，但是受生物信息學(xué)分析的影響較大，且穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選較為耗時(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期較長。我們?cè)诤笳叩幕A(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，首先將多種生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件的結(jié)果進(jìn)行合并，盡量排除利用單一或少數(shù)軟件分析所造成的誤差和遺漏；其次用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)替代單熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，利用內(nèi)置的Firefly熒光素酶作為內(nèi)參，消除了轉(zhuǎn)染效率可能造成的差異，從而不需要構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，使得實(shí)驗(yàn)周期大大縮短。我們利用該系統(tǒng)成功對(duì)泌尿系腫瘤中靶向OCT4基因的miRNAs進(jìn)行了系統(tǒng)分析[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)通過采用TargetScan等生物信息學(xué)軟件，初步對(duì)人P2X3 3′UTR進(jìn)行了綜合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別有21種潛在的miRNAs可能與人P2X3靶向結(jié)合，在此基礎(chǔ)上我們構(gòu)建了包含P2X3 3′UTR全長的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)psiCHECK2-P2X3，將該載體質(zhì)粒分別與上述21種miRNAs共轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞，然后通過檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄后水平的變化進(jìn)行篩選，初步證實(shí)共有3種miRNAs(hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291)能夠靶向結(jié)合P2X3的3′UTR，并顯著下調(diào)其表達(dá)，表明確實(shí)有miRNA參與了對(duì)P2X3的靶向調(diào)控。

由于目前無法獲得可用的正常膀胱尿路上皮細(xì)胞系，而基于293TN細(xì)胞系的miRNA研究比較成熟，故本實(shí)驗(yàn)中選取了293TN細(xì)胞系作為研究對(duì)象而非膀胱尿路上皮細(xì)胞系，我們希望通過本研究對(duì)miRNA治療OAB的可能性進(jìn)行一些探索。而經(jīng)293TN細(xì)胞系篩選出來的靶向調(diào)控P2X3的miRNAs能否在OAB的治療中起作用，需要進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。未來，我們將在OAB患者相關(guān)組織標(biāo)本中對(duì)分析得到的miRNAs進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并將篩選得到的P2X3相關(guān)miRNAs載體轉(zhuǎn)染OAB大鼠模型，以驗(yàn)證靶向調(diào)控P2X3的miRNAs對(duì)OAB動(dòng)物模型進(jìn)行治療的可行性和有效性。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)共有3種miRNAs(hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291)參與了對(duì)P2X3的靶向調(diào)控，為OAB的臨床診斷和靶向治療提供了新的策略和作用靶點(diǎn)。