孫夢(mèng)娜， 徐予△， 劉洪智， 岳鳳陽， 郝家亮， 陳昌， 孫志闊， 張春麗

1鄭州大學(xué)人民醫(yī)院(河南省人民醫(yī)院)心血管內(nèi)科(河南鄭州 450003)； 2阜外華中心血管病醫(yī)院心內(nèi)科(河南鄭州 450018)

Apelin是1998年發(fā)現(xiàn)的G蛋白耦聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體，廣泛存在于機(jī)體多種器官，如心、肺、腎、肝、脂肪組織、胃腸道、腦、腎上腺、內(nèi)皮、血漿等。Apelin-13是含有13個(gè)氨基酸的短肽，是人體血液中常見的Apelin亞型之一，具有較強(qiáng)的生物活性，其在外周組織和中樞系統(tǒng)中均有表達(dá)。已有研究顯示Apelin-13參與機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的病理生理過程，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、自噬、氧化應(yīng)激和凋亡的作用，故Apelin-13的研究具有一定的臨床意義[1-2]。而巨噬細(xì)胞可以在不同的刺激條件下分化為經(jīng)典的促炎亞群M1型或選擇性的抗炎亞群M2型。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，比如白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，表達(dá)CD86、CD16/32等[3]。M2亞型為選擇性激活亞型，其作用與M1亞型相反，主要以分泌IL-10，表達(dá)CD206為主。有研究顯示Apelin可通過調(diào)節(jié)核因子-κB(NF-κB)/JNK通路的基礎(chǔ)機(jī)制抑制炎癥，在缺氧條件下，Apelin可保護(hù)巨噬細(xì)胞免受凋亡，并可增強(qiáng)細(xì)胞遷移[4]，該結(jié)論具有一定的臨床意義。本研究旨在探討不同濃度Apelin-13對(duì)THP-1來源的人巨噬細(xì)胞極化的影響,其具有一定的臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)于2017年12月至2018年5月在鄭州大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。人單核細(xì)胞THP-1購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫(引進(jìn)于American Type Culture Collection ATCC)。RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自Solarbio公司，體積分?jǐn)?shù) 10% 胎牛血清 (fetal calf serum，F(xiàn)CS) 購自Gibco公司，佛波酯(PMA)和脂多糖(LPS) 購自 Sigma 公司，重組人γ干擾素(IFN-γ) 購自 Peprotech 公司，Apelin-13購自Cayman公司，抗體 FITC CD86 和 PE CD206 購自EXBIO公司，人轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、人IL-1β、人TNF-α、人IL-6、人IL-10、人IL-4 ELISA 試劑盒購自欣博盛公司。

1.2 方法

1.2.1 人巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo) 人單核細(xì)胞THP-1復(fù)蘇后加入5 mL含10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基(包含青霉素1 000 U/mL、鏈霉素100 mg/mL和谷氨酰胺2 mmol/L)后轉(zhuǎn)移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代。待THP-1細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)離心去除培養(yǎng)基，用PMA 50 ng/mL刺激培養(yǎng)THP-1，并接種在6孔板中，用加入體積分?jǐn)?shù)10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，獲得未分化巨噬細(xì)胞(M0)[5];參照Martinez等[6]的方法將M0 進(jìn)一步誘導(dǎo)，采用IFN-γ 20 ng/mL和LPS 200 ng/mL刺激培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)出M1型巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 不同濃度Apelin-13干預(yù)誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞 將生長狀態(tài)良好的誘導(dǎo)后的M1型人巨噬細(xì)胞胰蛋白酶處理后以5×104/孔濃度接種于12孔培養(yǎng)板上。貼壁生長6 h后，分別添加不同終濃度(100、500、1 000 ng/mL)的藥物Apelin-13(分別為低濃度組、中濃度組、高濃度組)，未添加藥物干預(yù)的人巨噬細(xì)胞組設(shè)為空白對(duì)照組，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3 細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 分別收集THP-1來源經(jīng) PMA+IFN-γ+LPS 誘導(dǎo)刺激48 h的貼壁細(xì)胞及Apelin-13干預(yù)后的貼壁巨噬細(xì)胞，調(diào)整至每管1×106，PBS洗1次，50 μL鞘液重懸，加入PE CD206 及FITC CD86， 避光室溫孵育30 min， 鞘液洗2遍，再用鞘液500 μL 重懸后用 BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，未與抗體作用的巨噬細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子分泌 分別收集對(duì)照組及不同濃度Apelin-13干預(yù)組的細(xì)胞培養(yǎng)上清。按照試劑盒說明操作, 將標(biāo)準(zhǔn)品及上述收集的培養(yǎng)上清加入相應(yīng)孔內(nèi)，100 μL/孔，37℃孵育90 min，洗板5次,分別加入生物素標(biāo)記人的 IL-6/TNF-α/IL-4/IL-10/TGF-β1/ IL-1β 抗體稀釋液及工作液(100 μL/孔)，37℃孵育60 min; 洗板5次，分別加入酶結(jié)合物稀釋液及工作液(100 μL/孔)，37℃ 避光孵育30 min; 洗板5次，加入TMB顯色工作液(100 μL/孔)，37℃避光孵育 15 min;加入終止液(100 μL/孔)，測(cè)定450 nm的吸光度(OD450)值。

2 結(jié)果

2.1 THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)和鑒定結(jié)果 THP-1細(xì)胞呈類圓形，懸浮生長(圖1-A)，經(jīng)PMA+IFN-γ+LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)逐漸變不規(guī)則，胞體增大，細(xì)胞表面伸出偽足，呈樹突狀、梭狀及放射狀，6 h開始逐漸貼壁，24 h基本貼壁，48 h后完全貼壁生長成巨噬細(xì)胞(M1,圖1-B)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示M1型巨噬細(xì)胞分化比例達(dá)到92%以上，適用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平的檢測(cè) 通過ELISA法檢測(cè)了空白對(duì)照組及不同濃度Apelin-13干預(yù)組中巨噬細(xì)胞幾種細(xì)胞因子的分泌水平(OD450值), 結(jié)果如表1所示, 與空白對(duì)照組相比，不同濃度Apelin-13干預(yù)組中巨噬細(xì)胞的IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌水平明顯降低(P<0.05)，且隨Apelin-13干預(yù)濃度升高，細(xì)胞因子分泌量逐漸減少，但中濃度組與低濃度組相比，細(xì)胞因子IL-1β的分泌量減少不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低濃度組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞因子TNF-α的分泌量減少不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而TGF-β1、IL-10、IL-4的分泌增加，尤其 TGF-β1分泌水平明顯增加(P<0.01)，且呈Apelin-13濃度依賴性，但中濃度組與低濃度組相比，細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1的分泌量增加不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.3 M1型巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá)的檢測(cè) 對(duì)已報(bào)道M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD86和M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD206的表達(dá)進(jìn)行了FACS檢測(cè)，結(jié)果如表2所示， Apelin-13干預(yù)后巨噬細(xì)胞表面CD86的表達(dá)陽性率較空白對(duì)照組顯著降低(P=0.000)，CD206的表達(dá)陽性率較空白對(duì)照組有顯著增加(P=0.000), 由低濃度組至高濃度組，CD86的陽性率逐漸減低，但中濃度組較低濃度組略有減低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.077)，而CD206的陽性率依次增加，但高濃度組較中濃度組略有增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.058)。

A: 未誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞; B:誘導(dǎo)刺激后的M1細(xì)胞

項(xiàng)目空白對(duì)照組低濃度組中濃度組高濃度組IL-61.704±0.0041.314±0.0070.880±0.0070.478±0.003IL-1β2.154±0.0031.594±0.0081.588±0.0020.931±0.004TNF-α1.374±0.0031.368±0.0030.665±0.0080.249±0.004IL-100.077±0.0020.106±0.0030.111±0.0040.168±0.002IL-40.068±0.0030.080±0.0020.110±0.0020.165±0.004TGF-β10.068±0.0020.093±0.0040.100±0.0020.244±0.009

項(xiàng)目空白對(duì)照組低濃度組中濃度組高濃度組CD8683.633±0.75121.400±0.40020.467±0.58614.733±0.451CD20612.067±1.73965.967±0.66676.133±1.00278.134±0.657

3 討論

巨噬細(xì)胞存在一系列連續(xù)的功能狀態(tài)，M1型與M2型分屬兩個(gè)極端[7]，M1型巨噬細(xì)胞通過分泌促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α等以及驅(qū)化因子參與正向免疫，發(fā)揮免疫監(jiān)視功能；M2型巨噬細(xì)胞通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10 、TGF-1β 、IL-4等對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)[8]。

有研究報(bào)道巨噬細(xì)胞不具有APJ受體，且不能對(duì)Apelin產(chǎn)生反應(yīng)[9-10],而本研究發(fā)現(xiàn):與空白對(duì)照組相比，隨藥物Apelin-13濃度的增加，Apelin-13干預(yù)組中棒狀、放射狀以及樹枝狀形態(tài)的巨噬細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞變圓，黏附性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多；且流式細(xì)胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD206陽性率依次增加，巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD86均為陰性(表2)。說明Apelin可以抑制M1型巨噬細(xì)胞的活性，進(jìn)一步促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向抗炎M2型分化，進(jìn)而導(dǎo)致IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性因子表達(dá)降低，TGF-1β、 IL-10、IL-4等抗炎因子表達(dá)增加(表1)。已有文獻(xiàn)報(bào)道Apelin-13可以通過抑制巨噬細(xì)胞來源的脂蛋白脂肪酶(LPL)，從而減少脂質(zhì)積累以及促炎細(xì)胞因子分泌,如IL-6、IL-1β、TNF-α[11-12]，該結(jié)論與本研究結(jié)果吻合，表明Apelin-13其在機(jī)體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中起一定作用。巨噬細(xì)胞可借 Toll 樣受體4(TLR4) 或 IL-1 信號(hào)激活 IκB 激酶(IKK) 復(fù)合物，通過 TLR2/核因子 κB(NF-κB) 關(guān)鍵炎癥信號(hào)通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的 M1型活化[13-15]， 而Apelin可抑制NF-κB /JNK信號(hào)通路，降低磷酸化NF-κB和磷酸化JNK的表達(dá)[4]。因此，這一機(jī)制可能是Apelin-13影響M1型巨噬細(xì)胞活性的原因。但本研究的一個(gè)局限性是沒有進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)，因此不能證實(shí)Apelin-13的應(yīng)用與Apelin/APJ系統(tǒng)直接相關(guān)。

綜上所述，Apelin-13可以促進(jìn)THP-1來源巨噬細(xì)胞由M1型向M2型分化，抑制M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子分泌。且細(xì)胞因子的分泌與Apelin-13呈一定的濃度依賴性。