蘇寶威， 白明輝， 劉海潮

鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院肝膽外科(河南洛陽 471009)

肝內(nèi)膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)一般指發(fā)生在肝臟二級膽管及以上的膽道上皮惡性腫瘤，屬原發(fā)性肝癌的一種，發(fā)病率約占原發(fā)性肝癌的10%～15%[1]，僅次于肝細胞癌，是第二大原發(fā)性肝惡性腫瘤[2]，其組織病理分型以腺癌常見，腫瘤大體觀可分為腫塊型、管內(nèi)生長型及管周浸潤型，又以腫塊型常見[3]，ICC發(fā)病率地域間存在明顯差異，但在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率及病死率均呈上升趨勢[4]。目前手術(shù)切除仍是ICC的首選治療方案[5]，但ICC發(fā)病隱匿，早期無明顯癥狀[6]，缺乏特異性的早期診斷腫瘤標(biāo)志物，且其惡性程度高，確診時大多都有肝內(nèi)或淋巴轉(zhuǎn)移，即使是手術(shù)切除，術(shù)后5年生存率僅為20%～40%，且ICC對傳統(tǒng)的化療、放療都不敏感，療效較差[7]，因此能否早期診斷ICC就尤為重要，近年來，人們通過大量研究ICC的生物學(xué)標(biāo)志物，期望能為早期診斷ICC并改善其預(yù)后提供幫助[8-9]。Fascin-1已被證實在多種上皮來源惡性腫瘤如食管癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌等中發(fā)揮作用[10]，但目前鮮見有Fascin-1與ICC的研究。本研究試圖分析ICC中Fascin-1的表達情況，并對患者進行隨訪來了解其與ICC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及對患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月至2018年1月的ICC標(biāo)本(58例)和正常肝內(nèi)膽管組織標(biāo)本(43例)，標(biāo)本蠟塊由鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院病理科提供，58例肝內(nèi)膽管細胞癌中男28例，女30例；中位年齡56.9歲(30～85歲)。病理分級：高分化癌23例，中分化癌21例，低分化癌14例，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期22例，無門脈受侵46例，門脈受侵12例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，有臟器轉(zhuǎn)移14例，無臟器轉(zhuǎn)移44例，乙型肝炎(乙肝)病毒攜帶34例，無乙肝組24例。所有標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)為：ICC患者均無腫瘤病史，術(shù)前未接受化療、放療及生物治療等，其病歷資料完整可查。選取的同期正常膽管上皮組織(膽管結(jié)石和膽道損傷時手術(shù)切除的膽管組織)43例作為對照組，所有患者均簽署知情同意書。試劑選擇：美國Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)：鼠抗人 Fascin-1單克隆抗體，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司：免疫組化試劑盒、PBS緩沖液，抗原修復(fù)液和DAB顯色試劑。鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院中心實驗室及病理科提供其他試劑及設(shè)備。

1.2 免疫組化SP法 蠟塊切片后常規(guī)脫蠟水化，修復(fù)抗原，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后加入山羊血清封閉抗原，加一抗過夜，復(fù)溫后加羊抗兔IgG，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水后封片，整個過程嚴格按免疫組化試劑盒說明進行，用血管內(nèi)皮細胞中Fascin-1的表達為陽性對照，陰性對照則用PBS溶液代替一抗。

1.3 結(jié)果判定 由經(jīng)驗豐富病理科醫(yī)師采用雙人雙盲閱片，F(xiàn)ascin-1陽性反應(yīng)物質(zhì)ICC中呈棕褐色或(和)棕黃色，主要定位為細胞質(zhì)中，參照黃英等[11]陽性細胞計數(shù)與染色強度相結(jié)合的二級計分法對 Fascin-1蛋白陽性表達結(jié)果進行判定。著色強度據(jù)反應(yīng)物顏色分為四級，依次計0～3分，陽性細胞所占百分比分為五級，依次計0～4分，兩者相乘為最終結(jié)果，小于4分為陰性， 4分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，采用2檢驗分析Fascin-1在ICC和正常膽管上皮組織中的表達及其與ICC臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法對生存曲線進行描述，并對Fascin-1蛋白表達陽性及陰性患者的生存差異進行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fascin-1在ICC及正常肝內(nèi)膽管組織中的表達 Fascin-1主要表達于細胞質(zhì)中，陽性顆粒棕黃色至棕褐色分布，見圖1。58例ICC組織中Fascin-1蛋白表達陽性29例，陽性率高達55.2%，而在正常肝內(nèi)膽管組織中不表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=34.727，P<0.05)，見表1。

A:Fascin-1在ICC中的表達;B:Fascin-1在正常肝內(nèi)膽管組織中的表達

圖1 免疫組化檢測Fascin-1蛋白的表達(SP,×400)

2.2 Fascin-1表達與ICC臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 不同年齡、性別、是否合并乙肝分組ICC患者ICC組織中Fascin-1陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ICC TNM分期：Fascin-1蛋白陽性率Ⅰ～Ⅱ期38.9%，Ⅲ～Ⅳ期81.8%；組織分化：Fascin-1蛋白陽性率高分化組26.1%，中低分化組74.3%；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：Fascin-1蛋白陽性率無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組35.9%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組94.7%；門靜脈受侵：Fascin-1蛋白陽性率無門脈侵犯組35.9%，門脈侵犯組83.3%，臟器轉(zhuǎn)移組：Fascin-1蛋白陽性率無臟器轉(zhuǎn)移組45.5%，臟器轉(zhuǎn)移組85.7%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 Fascin-1表達與ICC臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 例

2.3 生存分析 采用Kaplan-Meier方法統(tǒng)計分析示：58例ICC患者的中位生存時間為22個月，F(xiàn)ascin-1蛋白陰性組的ICC患者中位生存時間為30個月，F(xiàn)ascin-1蛋白陽性組的ICC患者中位生存時間為12個月(圖2)。Fascin-1蛋白陽性表達的ICC患者的預(yù)后明顯差于陰性表達患者(P=0.007)。

3 討論

Fascin蛋白最早發(fā)現(xiàn)于海膽母細胞胞質(zhì)中，目前認為其是一種細胞骨架蛋白，分子量55×103，包含493個氨基酸殘基，其編碼基因全長13 852 bp，位于7p22，有5個外顯子，其成熟mRNA長度為2 812 bp[10]?，F(xiàn)研究表明，F(xiàn)ascin蛋白能與F-actin蛋白結(jié)合，故又叫肌動蛋白結(jié)合蛋白，人們發(fā)現(xiàn)其與 傳統(tǒng)肌動蛋白結(jié)合蛋白同源性較差，所以將其歸納為一類新型的肌動蛋白結(jié)合蛋白家族(Fascin蛋白家族)?，F(xiàn)人類已知的Fascin蛋白有3種：Fascin-1存在于大多數(shù)脊椎動物細胞中，F(xiàn)ascin-2僅在視網(wǎng)膜中表達，F(xiàn)ascin-3則僅在睪丸組織中表達，目前對Fascin-1蛋白研究較多。腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是現(xiàn)在惡性腫瘤治療的難題，而腫瘤的轉(zhuǎn)移首先要突破基底層，研究表明[12]Fascin-1與F-actin蛋白結(jié)合可改變細胞膜的結(jié)構(gòu)，從而增加細胞遷移、轉(zhuǎn)移的能力。

圖2 Fascin-1蛋白表達與生存時間相關(guān)性分析

本研究試圖通過檢測Fascin-1在ICC組織中的表達,探討其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)58例ICC組織中Fascin-1呈陽性表達的有32例，陽性率高達55.2%，而在正常肝內(nèi)膽管組織中Fascin-1不表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Fascin-1與ICC的發(fā)生過程有一定關(guān)聯(lián)。Fascin-1在中低分化癌組織中的表達(74.3%)顯著高于其在高分化癌組織中的表達(26.1%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因此筆者推測Fascin-1與ICC的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。此外Fascin-1蛋白在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組高于Ⅰ～Ⅱ期組，且在門脈受侵組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和合并臟器轉(zhuǎn)移組的表達均顯著高于其對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示其可能與ICC的侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。而Fascin-1在ICC組織中的表達與患者的性別、年齡及是否合并乙肝等無統(tǒng)計學(xué)意義,這與Fascin-1在肺癌和結(jié)直腸癌[13-14]中的表達一致。據(jù)生存分析顯示，F(xiàn)ascin-1蛋白表達陽性組患者預(yù)后明顯比陰性組差，這與既往文獻[15-17]報道大致符合。劉迪生等[18]研究Fascin-1蛋白對腫瘤細胞的影響是通過細胞內(nèi)外信號途徑共同作用，當(dāng)細胞外基質(zhì)中纖維連接蛋白集結(jié)并激活GTP酶及PKCα，進一步使Fascin蛋白ser-39位點磷酸化，并促使活化的PKCα與該位點結(jié)合，進而導(dǎo)致含F(xiàn)ascin蛋白的細胞表面與侵襲移動相關(guān)的絲狀偽足、微棘和微突顯著變短或減少，致使細胞移動侵襲能力明顯增強。李恩民等[10]研究則認為，轉(zhuǎn)錄因子Sp1激活食管癌細胞Fascin基因啟動子核心元件，使EGF/EGFR/ERK1/2信號通路活化，磷酸化的Sp1進一步激活Fascin基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Fascin蛋白表達異常,該研究還指出，F(xiàn)ascin蛋白或其mRNA的過表達發(fā)生在食管癌早期，并伴隨腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，可作為臨床診斷的早期預(yù)警標(biāo)志。Mao等[19]研究指出,Fascin可能通過調(diào)節(jié)Wnt /β-Catenin信號誘導(dǎo)膽管癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，該研究顯示沉默F(xiàn)ascin后β-catenin發(fā)生磷酸化并在細胞核中的濃度降低，敲減Fascin后導(dǎo)致QBC939細胞膜中β-catenin 和E-cadherin表達上調(diào)，其具體機制還有待進一步研究。當(dāng)然，影響ICC的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移的因素非常復(fù)雜，F(xiàn)ascin-1只是其中之一。

綜上所述，F(xiàn)ascin-1與ICC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲等密切相關(guān)，但Fascin-1對腫瘤調(diào)控的機制非常復(fù)雜，具體還需進一步研究。近年來，在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，F(xiàn)ascin蛋白已被人熟知，尤其是在細胞骨架腫瘤生物學(xué)這一新的分支領(lǐng)域中，F(xiàn)ascin蛋白更是受人青睞，隨著對其進一步的研究，相信其一定會在腫瘤領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。