黃麗華, 盧雪珍, 黃瓊華

汕頭潮南民生醫(yī)院婦產科(廣東汕頭 515144)

子宮內膜癌(endometrial cancer，EC)是婦科最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率具有增加的趨勢，是世界范圍內女性群體中發(fā)病率第6高的腫瘤[1]。子宮內膜癌大多數早期治療的患者可以得到有效的控制，其中手術方式包括全子宮切除術和雙側輸卵管切除術、系統(tǒng)的盆腔/腹主動脈淋巴結清掃[2]。盡管如此，對于進展期子宮內膜癌的治療效果仍然較差，目前多采用放療和輔助性化療的治療方法[3]。目前腫瘤免疫治療已經成為腫瘤治療的新策略，研究[4]表明高密度瘤內CD8+T細胞浸潤的子宮內膜癌患者具有更好的臨床預后。且目前多種針對CD8+T細胞的免疫治療也正在臨床試驗中，但目前的免疫治療仍具有很大的限制，進一步明確子宮內膜癌中具體的免疫調控微環(huán)境對腫瘤的免疫調控和治療具有重要意義。淋巴結是控制免疫原性抗原免疫反應的最初器官之一，在抗腫瘤免疫環(huán)境下，各種惡性腫瘤的局部淋巴結被認為是免疫系統(tǒng)與腫瘤細胞或其產物接觸的第一個部位，碎片化的腫瘤細胞可以轉移流入淋巴竇，其中竇CD169+巨噬細胞內化，加工和呈遞MHC Ⅰ復合物上的抗原，誘導腫瘤抗原特異性T細胞活化[5]。研究[6]表明CD169+巨噬細胞在局部淋巴結中是參與抗腫瘤免疫反應的關鍵組成部分。淋巴結竇中的巨噬細胞特異性表達跨膜受體CD169，也稱為唾液酸黏附素或唾液酸結合凝集素(Siglec)-1。CD169結合唾液酸化糖蛋白，包括CD43和MUC1，并且參與介導細胞與細胞之間的黏附作用和細胞與病原體之間的相互作用。進一步研究[7]顯示CD169+巨噬細胞具有促炎的功能，并介導了T細胞和NK細胞的活化。但對于CD169+巨噬細胞在子宮內膜癌中的作用仍未明確。本研究旨在探討宮內膜癌組織中CD169+巨噬細胞浸潤密度與及對臨床預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年7月至2016年1月于我院行治療的子宮內膜癌患者共83例，納入標準：(1)經病理診斷為子宮內膜癌；(2)獲得患者知情同意；(3)病歷資料完整并獲得隨訪的患者；排除標準：(1)合并類風濕關節(jié)炎或全身免疫性疾病的患者；(2)合并其他腫瘤的患者。本研究向醫(yī)院倫理委員會審批并獲得批準。83例子宮內膜癌患者，年齡36～76歲，平均(57.3±9.3)歲。其中子宮內膜癌FIGO分期為Ⅰ期46例，Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期共12例。

1.2 免疫組化檢測方法 將手術切除下的子宮內膜癌組織常規(guī)地固定在10%中性緩沖甲醛溶液中，然后采用石蠟包埋。對石蠟進行3 μm厚度連續(xù)切片后，每個病例取2張切片。切片按常規(guī)脫蠟，3%H2O2處理10 min，蒸餾水洗3次，每次2 min。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92～98℃之間并持續(xù)10～15 min。取出容器，室溫冷卻10～20 min。然后在含 0.025% Triton Ⅹ-100 的 TBS 溶液中洗滌載片2次，每次 5 min。使用含10% 正常血清及 1% BSA 的 TBS 溶液室溫封閉 2 h。1% BSA 的 TBS 溶液稀釋一抗(CD68兔單克隆抗體，#76437，CST；CD169/Anti-Sialoadhesin, ab228293, abcam)，加一抗4℃ 下孵育過夜。含 0.025% Triton X-100 的 TBS 溶液中洗滌載片兩次，每次 5 min。使用含 1% BSA 的 TBS 溶液稀釋二抗，并將酶偶聯二抗涂覆于載片上然后在室溫下孵育 1 h，在室溫下用顯色底物顯色約 10 min，沖洗后采用蘇木精復染，放置后以進行光學顯微鏡檢查。

1.3 免疫組化評定 對每個病例的CD169和CD68切片隨機選擇5個視野，高倍鏡視野下(×200)對CD169和CD68陽性的細胞進行計數，具體陽性的細胞采用Image J軟件分析，通過5個視野中CD169和CD68陽性的細胞進行計數取平均值；根據83例患者中CD169和CD68陽性的細胞數中，取計數的中位值作為cut-off值，分為高密度和低密度，其中CD169≥70個/高倍鏡為高密度，CD169<70個/高倍鏡為低密度；取CD169/CD68的密度比0.8為cut-off值，CD169/CD68≥0.8為高密度比，CD169/ CD68<0.8為低密度比。

1.4 臨床資料收集和隨訪 記錄所有患者的年齡、患者經期情況，腫瘤FIGO分期、病理資料情況，包括病理分級、肌層浸潤深度、血管浸潤和淋巴結轉移情況?；颊咝g后至少每3個月復診1次，記錄所有患者的隨訪和預后情況。

2 結果

2.1 CD169和CD68巨噬細胞在EC中的浸潤情況 83例子宮內膜癌組織中，CD169+巨噬細胞平均為(69.4±16.2)個/高倍鏡，其中高浸潤密度(≥70個/高倍鏡)共42例，低浸潤密度(<70個/高倍鏡)共41例；CD68+巨噬細胞平均(82.3±22.7)個/高倍鏡，CD169/ CD68為高密度比的共46例，低密度比共37例。見圖1。

A、B 分別為CD169陽性巨噬細胞在子宮內膜癌組織中低密度浸潤和高密度浸潤；C、D分別為CD68陽性巨噬細胞在子宮內膜癌組織中低密度浸潤和高密度浸潤

圖1CD169和CD68陽性巨噬細胞在EC組織中的浸潤情況(免疫組化，×200)

2.2 CD169+巨噬細胞及CD169/CD68密度比與子宮內膜癌臨床特征的關系 其中CD169+巨噬細胞在子宮內膜癌中的浸潤密度與CD169/CD68在子宮內膜癌中的密度比與子宮內膜癌的臨床分期、淋巴結轉移密切相關，臨床分期為Ⅰ期的患者其CD169+巨噬細胞高浸潤密度和CD169/CD68高密度比患者的比例顯著高于Ⅱ～Ⅳ期，淋巴結轉移陰性患者其CD169+巨噬細胞高浸潤密度和CD169/CD68高密度比患者的比例顯著高于淋巴結轉移陽性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而不同年齡、病理分級、肌層浸潤深度、血管浸潤、是否絕經的患者其子宮內膜癌中CD169+巨噬細胞和CD169/CD68密度比比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 CD169+巨噬細胞及CD169/CD68密度比與EC臨床特征的關系 例

2.3 CD169+巨噬細胞及CD169/CD68密度比與子宮內膜癌臨床預后的關系 所有患者隨訪時間為6～36個月，中位隨訪時間為27個月，其中子宮內膜癌組織CD169 巨噬細胞高密度患者的總體生存率為80.13%，CD169 巨噬細胞低密度總體生存率為53.95%，CD169 巨噬細胞高密度的總體生存率顯著優(yōu)于CD169 巨噬細胞低密度的患者，差異有統(tǒng)計學意義(HR=0.366，95%CI：0.160～0.838，P=0.017 5)；子宮內膜癌組織CD169/CD68高密度比患者的總體生存率為83.31%，CD169/CD68低密度比總體生存率為50.63%，CD169/CD68高密度比患者的總體生存率顯著優(yōu)于CD169/ CD68低密度比的患者，差異有統(tǒng)計學意義(HR=0.302，95%CI：0.132～0.692，P=0.004 7)，見圖2。

A:CD169;B:CD169/CD68

3 討論

子宮內膜癌是最常見的女性惡性腫瘤，但其中腫瘤相關巨噬細胞在子宮內膜癌中具體的機制仍需要進一步深入研究。帶有不同表面標記物的腫瘤相關巨噬細胞其功能不同，既往研究[8]表明，直腸癌或黑色素瘤患者中CD169+巨噬細胞在腫瘤組織高密度浸潤能獲得更好的臨床預后，且CD169+巨噬細胞的浸潤水平與CD8+T細胞浸潤密度呈正相關。雖然有部分研究[9]顯示局部淋巴結中CD169+巨噬細胞的密度并不一定是總生存的獨立危險因素，但有更多的CD169+巨噬細胞和CD169和CD68+巨噬細胞的比例增加也顯示了能獲得更好的預后[10]，表明了CD169+巨噬細胞在不同的腫瘤甚至不同的個體中發(fā)揮的功能存在一定的差異。本研究結果顯示子宮內膜癌組織中CD169+巨噬細胞浸潤密度和CD169/CD68密度比與患者的臨床分期，淋巴結轉移以及臨床預后均具有密切的關系。

既往研究[11]顯示,CD169+巨噬細胞與自然殺傷(NK)細胞具有密切的關系。NK細胞也存在于多種腫瘤微環(huán)境中，被認為參與機體對惡性腫瘤的免疫應答，臨床前研究[12]表明， NK細胞有效地殺死幾乎任何來源的循環(huán)腫瘤細胞，但殺死腫瘤外浸潤的腫瘤細胞的能力取決于NK細胞的活化水平。Garcia等[13]研究顯示，CD169+巨噬細胞在吞噬病毒顆粒后促進了NK細胞的積聚和活化。Coombes等[14]研究表明，具有炎性功能的CD169+巨噬細胞是淋巴結竇區(qū)NK細胞活化的關鍵調控細胞。盡管CD169+巨噬細胞介導的NK細胞活化的完整機制尚不清楚。本研究顯示了CD169+巨噬細胞高密度浸潤，淋巴結轉移的患者更少，且低臨床分期患者的比例更多，表明了CD169+巨噬細胞對子宮內膜癌中局部淋巴結轉移具有一定的抑制作用。其具體發(fā)揮的機制可能是通過活化NK細胞介導免疫應答相關，具體可能是通過CD169+巨噬細胞分泌IFN-α發(fā)揮作用。但本研究并未進一步檢測NK細胞的浸潤情況，具體的關系仍需要進一步通過臨床病例組織確認。

CD169+巨噬細胞也可能通過其他機制促成抗癌免疫。調節(jié)性T細胞(Treg)在其表面上表達CD169配體，允許其與CD169+巨噬細胞相互作用，其通過CD169+巨噬細胞介導的Treg抑制促進炎癥作用[15]。因此，CD169+巨噬細胞可能抑制局部淋巴結中的Treg細胞從而增強抗癌免疫。此外，腫瘤組織中的CD8+淋巴細胞是發(fā)揮促進抗癌作用的關鍵[16]，CD169+巨噬細胞具有抑制Treg細胞的功能，既往也有研究[17]顯示CD169+巨噬細胞與CD8T細胞浸潤密度密切相關，因此，在子宮內膜癌組織中進一步評估CD169+細胞與CD8 T細胞浸潤之間的相關性具有重要意義。

綜上所述，本研究結果顯示了CD169相關巨噬細胞在子宮內膜癌中與臨床分期及淋巴結轉移密切相關， CD169+巨噬細胞高密度浸潤的子宮內膜癌患者具有更好的臨床預后。表明了子宮內膜癌組織中CD169相關巨噬細胞浸潤是子宮內膜癌患者臨床預后和介導子宮內膜癌免疫治療的潛在靶標。