唐浩斌, 鄧太海, 谷婷婷， 陳舒華△

1廣東醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院(廣東湛江 524000); 2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(江西贛州 341000); 3佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣東佛山 528000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是源于鼻咽部的惡性腫瘤，是我國廣東地區(qū)的高發(fā)癌癥[1]，男性年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率(ASR)為30/10萬，女性ASR為13/10萬，遠(yuǎn)超世界其他地區(qū)(ASR<1/10萬)[2]，具有明顯的地域性，早有學(xué)者提出地域性的基礎(chǔ)源于家族的遺傳性，可追溯至先秦時(shí)期的百越先民[3]。而近數(shù)十年的研究也不斷證實(shí)了家族史與EB病毒一樣，與鼻咽癌具有強(qiáng)相關(guān)性[4-7]。在鼻咽癌高發(fā)區(qū)，鼻咽癌患者的一級(jí)親屬是高危人群[8-9]。因此，鼻咽癌高癌家系患者的早期診斷以及對高癌家系患者的一級(jí)親屬的早期篩查顯得尤為重要。本研究組曾對鼻咽癌高癌家系患者的外周血及病理組織進(jìn)行MALDI-TOF-MS初篩，發(fā)現(xiàn)膜連蛋白A7(Annexin A7)出現(xiàn)異常表達(dá)[10]。Annexin A7是鈣離子依賴磷脂結(jié)合蛋白多基因家族的一員，與細(xì)胞膜運(yùn)輸、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化和增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]，在前列腺癌、消化道腫瘤、乳腺癌中均有明顯的異常表達(dá)[12]。但Annexin A7和高癌家系鼻咽癌患者存在何種關(guān)系，此前鮮有報(bào)道。因此檢測Annexin A7在鼻咽癌高癌家系癌患者中的表達(dá)情況，初步揭示兩者之間的關(guān)系，并且對以后我們尋找高度特異性的鼻咽癌腫瘤分子標(biāo)記物提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有的鼻咽組織標(biāo)本均取自佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻喉科2009年7—10月門診患者，其中高癌家系鼻咽癌組織15例、散發(fā)性鼻咽癌組織15例、鼻咽黏膜慢性炎癥患者鼻咽組織15例。這些患者均有完整的臨床及病理資料，在30例鼻咽癌標(biāo)本中，男17例，女13例，根據(jù)鼻咽癌2008分期[13]進(jìn)行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期18例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。年齡在20～78歲之間。取出鼻咽組織迅速放入凍存管中，液氮速凍后，置-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 檢測材料 RT-PCR試劑盒、Trizol試劑盒、辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗等購于北京鼎國生物技術(shù)公司。小鼠抗人Annexin A7抗體、β-actin抗體購于美國Sant Cruz公司。

1.3 RT-PCR檢測Annexin A7與α-enolase mRNA的表達(dá) 按照Trizol試劑盒說明對標(biāo)本進(jìn)行總RNA的抽提。提取后進(jìn)行取部分進(jìn)行電泳，在紫外透射儀上觀察，確認(rèn)提取RNA的完整性及質(zhì)量。同時(shí)使用紫外分光光度計(jì)上測定A260/A280比值，確保DNA沒有污染。確保提取RNA可用后運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系：隨機(jī)引物1 μL，dNTPs 1 μL，5×RT buffer 4 μL，酶混合液1 μL，目的RNA 3 μL，DEPC-ddH2O 10 μL，總體積為20 μL。反應(yīng)條件：42℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃ 1～5 min。取cDNA進(jìn)行進(jìn)行PCR定量擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA 3 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq 酶1 μL，ddH2O 38 μL，總體積50 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，引物57℃退火30 s，72℃延伸40 s，一共完成35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因的相對基因量。

引物由上海生工生物工程技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成。具體如下：Annexin A7基因引物序列：上游引物5′-GGGAAATCGTGATGAGAACCAG-3′,下游引物5′-GCCCACAATAGCCAGAAGAAG-3′,擴(kuò)增片段長度321 bp；β-actin基因引物序列：上游引物 5′-CACCAAATGGGACGACAT-3′,下游引物5′-ACAGCCTGGATAGCAACG-3′，擴(kuò)增長度189 bp。

1.4 Western blot檢測Annexin A7蛋白的表達(dá) 將標(biāo)本組織裂解提取蛋白質(zhì)，通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取100 μg蛋白樣品行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，通過一抗[鼠抗人AnnexinA7單克隆抗體及β-actin抗體(內(nèi)參照)]和二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG)反應(yīng)，最后經(jīng)過DAB顯色劑顯色。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 在高癌家系鼻咽癌組、散發(fā)性鼻咽癌組及鼻咽黏膜慢性炎癥組中Annexin A7 mRNA的表達(dá)量依次為0.828±0.046、0.459±0.048、0.312±0.072,3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且組間兩兩比較結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Annexin A7 mRNA在高癌家系鼻咽癌組織及散發(fā)鼻咽癌組織中表達(dá)均有上調(diào)，其中高癌家系顯著上調(diào)(圖1)。

*P<0.05

2.2 Western blot蛋白免疫印跡結(jié)果 在高癌家系鼻咽癌組、散發(fā)性鼻咽癌組及鼻咽黏膜慢性炎癥組鼻咽組織中Annexin A7相對密度值依次為0.867±0.068、0.624±0.065、0.392±0.087，3組間比較結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且組間兩兩比較結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在高癌家系鼻咽癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)(圖2)。而且Annexin A7蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者的年齡﹑性別無關(guān)。Annexin A7蛋白在Ⅲ～Ⅳ期的表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

*P<0.05

臨床因素例數(shù)Annexin A7蛋白表達(dá)t值P值分期2.3730.025 Ⅰ～Ⅱ期120.676±0.036 Ⅲ～Ⅳ期180.792±0.031淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3.0510.005 有160.810±0.032 無140.672±0.032性別0.7940.434 男170.764±0.035 女130.722±0.037年齡0.3880.701 ≤40歲160.736±0.033 >40歲140.756±0.041

3 討論

Annexin A7最早被發(fā)現(xiàn)于1978年[14]，其基因定位于人類染色體10q21.1～21.2，有47 kD和51 kD兩種亞型[15]，受蛋白激酶調(diào)節(jié)鈣離子依賴性GTP酶的控制，通過介導(dǎo)Ca2+/GTP信號(hào)通路在細(xì)胞外膜發(fā)揮作用[11]。Annexin A7在肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。Srivastava等[12]發(fā)現(xiàn)Annexin A7在人肝癌組織中高表達(dá)。Bai等[16]的研究表明Annexin A7協(xié)同Bcl-2影響肝癌的細(xì)胞凋亡過程。而Ye等[17]的研究則揭示Annexin A7參與了胃癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)其蛋白表達(dá)水平也與胃癌細(xì)胞的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)[18]。Torosyan等[19]的研究發(fā)現(xiàn)了Annexin A7能夠抑制激素敏感型的前列腺癌細(xì)胞的增殖，提示其在前列腺癌中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。早在2004年，Srivastava等[20]就發(fā)現(xiàn)Annexin A7在乳腺癌組織中高表達(dá)，而近期Huang等[21]的研究也提示著Annexin A7的表達(dá)水平與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。而本研究組前期研究也發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者的外周血中Annexin A7存在高表達(dá)。

本次研究，鼻咽癌高癌家系患者及散發(fā)性鼻咽癌患者組織中的Annexin A7在mRNA及蛋白水平上均出現(xiàn)了高表達(dá)，與鼻咽慢性炎癥患者組織的低表達(dá)水平存在顯著性差異(P<0.05)，這表明Annexin A7在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)翻譯水平的表達(dá)是一致，這提示該蛋白為鼻咽癌的差異性表達(dá)蛋白，進(jìn)一步證實(shí)了本課題組前期研究的成果[10]。Annexin A7在鼻咽癌組織中的高表達(dá)，與其在乳腺癌組織中的表達(dá)相似[20-21]，這提示其可能作為癌基因而影響鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展的。結(jié)合Ji等[22]的研究結(jié)果可以推測Annexin A7在高癌家系鼻咽癌患者中的高表達(dá)，可能激活了Ras-Raf-MAPK通路，使癌細(xì)胞異常的生長、增殖及分化，從而影響癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。但是，Annexin A7在不同的腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，既有扮演癌基因角色的[12]，也有以抑癌基因出現(xiàn)的[19]，目前其如何在鼻咽癌中產(chǎn)生作用依然沒有確切定論，因此，Annexin A7在高癌家系鼻咽癌中發(fā)揮著怎樣的功能與機(jī)制我們還需進(jìn)一步研究。

另一方面，本研究中，Annexin A7在鼻咽癌高癌家系及散發(fā)性鼻咽癌兩組患者中的表達(dá)存在顯著性差異，在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯層面，高癌家系患者的Annexin A7表達(dá)均明顯高于散發(fā)性患者。既往研究[4-7]已表明家族史為鼻咽癌的相關(guān)性因素，具有鼻咽癌家族史的正常人更容易出現(xiàn)鼻咽癌，這提示易感人群的鼻咽組織中癌基因處于略高水平的活躍狀態(tài)。因此，結(jié)合本研究組對F-肌動(dòng)蛋白α亞基[23]、陳舒華等[24]的研究結(jié)果后，我們推測，鼻咽癌高癌家系成員本身的Annexin A7及其他生物標(biāo)志物已處在略高于正常人的表達(dá)水平，導(dǎo)致其發(fā)病后表達(dá)水平進(jìn)一步升高。反推過來，通過這個(gè)差異，我們可以在眾多鼻咽癌患者中發(fā)現(xiàn)高癌家系患者，進(jìn)而可以對高癌家系成員進(jìn)行早期的篩查，這對高癌家系患者一級(jí)親屬的鼻咽癌篩查和干預(yù)有著重要的價(jià)值。

此外，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Annexin A7蛋白在Ⅲ～Ⅳ期的表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與楊民正等[25]得出的結(jié)果相符。由此看出，Annexin A7和鼻咽癌的發(fā)展過程密切相關(guān)，它可以在一定程度反映鼻咽癌惡性程度和浸潤轉(zhuǎn)移程度。這提示我們檢測Annexin A7的表達(dá)情況可以評估鼻咽癌的嚴(yán)重程度和惡性程度。

綜上所述，本研究通過分析鼻咽癌高癌家系患者、散發(fā)性鼻咽癌患者及鼻咽慢性炎癥患者的鼻咽組織中的Annexin A7表達(dá)水平，推測Annexin A7參與了鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的過程，并發(fā)揮了重要作用。有介于此，Annexin A7有望成為鼻咽癌患者早期評估，特別是高癌家系患者及其近親的早期篩查的指標(biāo)之一。同時(shí)，Annexin A7的表達(dá)和腫瘤的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，也可作為評估腫瘤疾病的嚴(yán)重程度和惡性程度的指標(biāo)，從而指導(dǎo)腫瘤疾病的治療。