張姝 靳曉娜 黨永紅 霍力 李方

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京市核醫(yī)學(xué)分子靶向診治重點實驗室 100730

Notch 信號通路是一種普遍存在于從果蠅到哺乳動物等眾多生命體中具有高度保守性的關(guān)鍵信號通路，其功能是參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡、黏附及器官發(fā)育。Notch 信號通路是 由Notch 受 體、Notch 配 體 和CSL（CBF-1、suppressor of hairless、Lag 的 合 稱）-DNA 結(jié) 合 蛋白3 部分組成。Notch 受體和配體均在細(xì)胞膜上表達(dá)。Notch 受體胞外區(qū)是配體結(jié)合并激活Notch 受體的部位，Notch 受體胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，NICD)為其活性成分，未成熟的Notch 受體與鄰近細(xì)胞配體結(jié)合后被激活，經(jīng)過3 次裂解產(chǎn)生活性成分NICD。而關(guān)鍵的裂解發(fā)生在S3 位點，即由γ 分泌酶介導(dǎo)的切割作用而產(chǎn)生NICD。當(dāng)NICD 進(jìn)入核內(nèi)后，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。近年來，許多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Notch 信號通路失調(diào)與包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)，在這些腫瘤中發(fā)現(xiàn)Notch 通路持續(xù)活化[1-5]。(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT）是一種γ 分泌酶抑制劑，能夠通過阻斷Notch 信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲[6-7]。本研究以DAPT 為前體進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)實驗，合成11C-N-甲基-DAPT(簡稱11C-DAPT)，初步研究其在正常新西蘭兔體內(nèi)的動態(tài)分布，為進(jìn)一步開展此類腫瘤特異性顯像劑的轉(zhuǎn)化研究及指導(dǎo)同類腫瘤分子靶向藥物的治療奠定基礎(chǔ)、提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2 由德國海德堡大學(xué)Freiss.H 教授惠贈。DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS 均購自美國Hyclone 公司；DAPT購自美國Selleck 公司；二甲基亞砜購自美國Sigma/Aldrich 公司。NucleoCounter NC-100 型全自動細(xì)胞計數(shù)儀購自丹麥chemometec 公司；Sep-Pak QMA SPE 分離柱購自美國Waters 公司。使用美國GE 公司的MINItrace Ⅱ回旋加速器、TRACERlab FXC Pro 合成模塊和Elite PET/CT。

1.2 實驗動物

普通級雄性新西蘭兔1 只，3月齡，體質(zhì)量3 kg，許可證編號：SYXK(京，2015-0025)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞計數(shù)Kit-8（簡稱CCK-8）法檢測DAPT和CH3-DAPT 對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2 培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液（加10%胎牛血清），在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代3 代以上進(jìn)行實驗。經(jīng)傳代后的人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2 用0.25%胰酶進(jìn)行消化，用DMEM 培養(yǎng)液制成單個細(xì)胞懸液，用全自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個/mL，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔體積100 μL。在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，分別加入不同濃度梯度的DAPT（30、45、60、70、80、90、 120 μmol/L）和CH3-DAPT（10、20、40、80、120、160、200 μmol/L）溶液，二者均溶于DMEM 培養(yǎng)液。同時設(shè)置對照組和空白組，對照組加入相同體積的DMEM 培養(yǎng)液，空白組無細(xì)胞只加培養(yǎng)液。DAPT 和CH3-DAPT（實驗組）均設(shè)5 個復(fù)孔。37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。CCK-8 法測定每組各孔的光密度（optical density，OD）值。

使用SPSS19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)ogit 回歸分析，并計算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)

1.3.2 自動化合成11C-DAPT

回旋加速器生產(chǎn)11C-CO2，在全自動合成儀上經(jīng)H2還原得到11C-CH4，11C-CH4與I2反應(yīng)生成11C-CH3I 后轉(zhuǎn)入反應(yīng)瓶；2 mg 前體DAPT 溶于0.4 mL二甲基亞砜，預(yù)先置于反應(yīng)瓶中，加入7 μL 5 mol/L NaOH ，充分振蕩混勻。11C-CH3I 與DAPT 混合，標(biāo)記反應(yīng)80℃，反應(yīng)時間3 min，洗脫液終止反應(yīng)，降溫冷卻至35°C。產(chǎn)物使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀進(jìn)行分離純化（C18柱，洗脫液300 mL 30%乙醇，流速2.5 mL/min，紫外線254 nm），收集產(chǎn)物，生理鹽水稀釋，無菌濾膜過濾待用。11C-DAPT 的合成路線見圖1。

1.3.3 正常兔11C-DAPT PET/CT 顯像

新西蘭兔1 只，耳緣靜脈注射125.8 MBq（3.4 mCi）11C-DAPT 后用PET/CT 進(jìn)行動態(tài)掃描，0、7、14、21、28 min 各 采 集1 次，共5 次。CT 掃描參數(shù)：電壓120 kV，電流150 mA，層厚5 mm；PET 掃描參數(shù)：1 min/床位，共4 個床位。掃描結(jié)束后，對原始圖像采用OSEM 圖像重建技術(shù)進(jìn)行重建。獲得CT、PET 及二者融合圖像。在主要臟器勾畫ROI，測量放射性濃度（kBq/mL）及其隨時間的變化。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DAPT 和CH3-DAPT 對胰腺癌細(xì)胞

MIAPaCa-2 增殖的影響

CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，DAPT 和CH3-DAPT對胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2 增殖的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。DAPT 和CH3-DAPT 作用于胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2 后72 h，細(xì)胞增殖的IC50分別為64.2 μmol/L 和180.0 μmol/L。

2.2 11C-DAPT 的鑒定結(jié)果

11C-DAPT 整個合成過程大約30 min，放射化學(xué)產(chǎn)率25%～35%（未校正，3 次重復(fù)試驗），放射化學(xué)純度＞95%。HPLC 檢測11C-DAPT 與12C-DAPT標(biāo)準(zhǔn)品保留時間一致，大約在5.3 min 時（圖2、3）。

2.3 11C-DAPT 在正常兔體內(nèi)的分布

兔注射11C-DAPT 后，體內(nèi)吸收迅速，以腎臟分布較多，肝臟、腸道、肺、腦等臟器攝取較低。7 min 時肝臟、腎臟攝取達(dá)到高峰，28 min 后降低＞50%（表1）。注射后即刻掃描，腸道、腦及肺的放射性攝取達(dá)到高峰，隨時間延長逐漸降低。0～21 min，隨時間延長，膀胱的放射性攝取逐漸增高。兔喉部前方可見放射性攝取增高組織，且隨時間延長攝取逐漸降低，但受PET/CT 分辨率的影響，無法明確具體器官來源。圖4和圖5顯示注射11C-DAPT 后正常兔的PET/CT 圖像。

3 討論

近年來有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與持續(xù)活化Notch 信號通路相關(guān)[8]。另外，Notch 信號通路能夠促進(jìn)癌癥干細(xì)胞的形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，通過藥物性阻斷該通道能夠抑制腫瘤的生長、克服化療藥物耐藥性[9-11]。Notch 信號通路藥物性阻斷劑包括單克隆抗體、γ 分泌酶抑制劑、小分子干擾RNA和天然化合物。其中γ 分泌酶抑制劑靶向藥為目前最被廣泛及深入研究的Notch 信號通路藥物性阻斷劑，包括RO4929097、MK-0752 和DAPT等[11-12]。

圖1 11C-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）的合成路線圖 Fig.1 Radiosynthetic route of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)

胰腺癌為消化系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤，5年生存率低于5%[13]。胰腺癌對放化療不敏感，目前手術(shù)是治療胰腺癌最有效手段，大約60%的胰腺癌患者在確診時已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，25%為局部晚期患者，且不能進(jìn)行根治切除術(shù)[14]。因此，尋找和建立早發(fā)現(xiàn)、早診斷的方法，開發(fā)靶向治療藥物，成為提高胰腺癌診療效果的主攻方向之一。臨床前研究結(jié)果證實，DAPT 能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的生長、促進(jìn)凋亡，與化療藥物聯(lián)合使用可以提高化療效果[6-7,15]。本研究觀察了不同濃度的DAPT 對人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaca-2 增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAPT 對該細(xì)胞株增殖的抑制作用呈劑量依賴性關(guān)系，與杜瀟等[6]研究結(jié)果一致；同時使用CH3-DAPT 作 用 于MiaPaca-2 細(xì)胞，結(jié)果表明其對該細(xì)胞株的增殖亦有抑制作用。雖然CH3-DAPT 的抑制作用弱于DAPT，但說明CH3-DAPT 未改變DAPT 的生物學(xué)特性，仍可作用于胰腺癌細(xì)胞，發(fā)揮抑制增殖作用，為11C-DAPT 作為分子探針進(jìn)行胰腺癌的顯像提供了理論依據(jù)。

圖2 12C-DAPT 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 保留時間圖 圖中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯；HPLC：高效液相色譜。 Fig.2 Retention time of reference substance 12C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in analytic HPLC

圖3 11C-DAPT HPLC 純化后的保留時間圖 圖中，DAPT：(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯；HPLC：高效液相色譜。 Fig.3 Retention time of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine tbutyl ester(DAPT) purified by preparative HPLC

表1 11C-DAPT 在正常新西蘭兔體內(nèi)的生物學(xué)分布（ ±s，n=1）Table 1 Biodistribution of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in normal New Zealand rabbit

表1 11C-DAPT 在正常新西蘭兔體內(nèi)的生物學(xué)分布（ ±s，n=1）Table 1 Biodistribution of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT) in normal New Zealand rabbit

注：表中，DAPT：(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯；ROI：感興趣區(qū)。

組織 ROI 的放射性濃度 (kBq/mL)0 min 7 min 14 min 21 min 28 min腦 38.3±1.53 26.6±0.58 23.3±0.58 16.0±1.00 14.0±0.00肺 40.6±2.52 28.3±2.08 20.0±2.64 12.6±1.52 12.3±0.58肝臟 57.0±1.73 66.7±0.58 50.3±0.58 45.3±1.57 30.0±1.00腸道 43.3±3.51 35.0±3.00 27.3±1.53 21.3±1.53 16.7±0.58腎臟 83.7±3.06 123.6±5.69 75.3±2.31 65.0±2.65 51.6±3.06膀胱 2.3±0.58 3.3±1.15 29.7±0.58 60.0±0.00 49.7±0.58

11C 標(biāo)記的分子探針通常是將11C-CH3標(biāo)記到有機化合物中，是PET 放射性藥物合成的重要手段之一。本研究使用11C 標(biāo)記DAPT，不會引起原生物分子化學(xué)性質(zhì)的變化，而且方法靈活、過程簡單。查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，未見關(guān)于Notch 信號通路抑制劑分子探針的報道，考慮到DAPT 具有3 個甲基化取代位點，更容易被標(biāo)記，所以選擇以DAPT 作為前體，整個合成過程由合成器自動完成，經(jīng)過多次實驗、分析，發(fā)現(xiàn)將淋洗液乙醇濃度調(diào)整為30%時，合成效率為25%～30%，放射化學(xué)純度大于95%。整個合成過程簡單、快速，放射化學(xué)純度高。本研究的分布實驗結(jié)果顯示，注射11C-DAPT后藥物快速分布于各臟器，在腎臟攝取最多，肝臟攝取較少，腸道、腦和肺攝取低。在7 min 時肝臟和腎臟放射性濃聚達(dá)到高峰，28 min 時降低＞50%。而膀胱內(nèi)放射性攝取隨時間的增加逐漸增多，這說明11C-DAPT 主要通過腎臟排泄，在體內(nèi)清除快。胰腺和脾臟因體積較小，且與鄰近腸道組織難以區(qū)分，勾畫ROI 較困難，未測量放射性濃度。但是從圖像觀察，除了腎臟，腹腔內(nèi)其他臟器放射性攝取較低，具有較低的本底，為進(jìn)行胰腺病變的研究奠定了基礎(chǔ)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)喉部前方軟組織內(nèi)可見較高的放射性攝取，隨時間延長逐漸降低，通過PET/CT 大體的定位，考慮為頜下腺的可能性大，并且文獻(xiàn)報道Notch 信號通路調(diào)節(jié)唾液腺的發(fā)育以及再生，Notch1～4 受體在唾液腺細(xì)胞表面均有表達(dá)[16-17]。在后續(xù)的實驗中，將用小鼠做離體測量，通過測量各器官（包括胰腺、脾臟、頜下腺等）的放射性計數(shù)，進(jìn)一步明確11C-DAPT 的生物學(xué)分布。

綜上，本研究體外細(xì)胞實驗結(jié)果證明，DAPT 甲基化未改變DAPT的生物學(xué)特性，仍能夠作用于胰腺癌細(xì)胞，抑制其增殖，在此基礎(chǔ)上本研究成功制備了基于Notch 信號通路抑制劑的分子探針11C-DAPT，合成過程簡便、快速，放射化學(xué)純度高，生物學(xué)分布提示11C-DAPT 在肝臟、腸道的攝取低，為11C-DAPT 進(jìn)行胰腺癌的顯像奠定了基礎(chǔ)。我們下一步將建立胰腺癌皮下移植瘤動物模型，觀察胰腺癌對11C-DAPT 的攝取情況，進(jìn)一步探索11C-DAPT 作為胰腺癌新型靶向分子探針的可能性。

圖4 新西蘭兔注射11C-DAPT 后不同時間的PET 冠狀位圖像 圖中，A：0 min；B：7 min；C：14 min；D：21 min；E：28 min。DAPT：(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨?；?S-苯基甘氨酸叔丁酯。 Fig.4 Coronal PET images of New Zealand rabbit at different time point after injection of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester(DAPT)

圖5 新西蘭兔注射11C-DAPT 14 min 后的PET/CT 冠狀位圖像 圖中，DAPT：(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨酰基-S-苯基甘氨酸叔丁酯。 Fig.5 Coronal PET,CT and fusion images of New Zealand rabbit at 14 min after injection of 11C-N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester