107例泛發(fā)性膿皰型銀屑病IL36RN基因突變檢測(cè)及基因型-臨床表型相關(guān)性分析

李璐璐 付希安 王真真 于功奇 劉 紅 張福仁

泛發(fā)性膿皰型銀屑病(generalized pustular psoriasis, GPP)是一種泛發(fā)的、反復(fù)發(fā)作的系統(tǒng)性炎癥性皮膚病。該病常伴有白細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白升高等，嚴(yán)重者可并發(fā)內(nèi)臟器官損害，甚至危及生命。該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究已經(jīng)證實(shí)遺傳因素在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。最早，Marrakchi等[2]提出白介素36受體拮抗基因(interleukin36 receptor antagonist gene，IL36RN)突變與家族性GPP的發(fā)病相關(guān)，IL36RN突變引起的白細(xì)胞介素36受體拮抗劑(interleukin-36 receptor antagonist，IL36Ra)活性降低(deficiency of interleukin thirtysixreceptor antagonist, DITRA)可能是引起泛發(fā)性膿皰型銀屑病(GPP)無菌性膿皰產(chǎn)生的重要原因。根據(jù)病程的發(fā)展過程中是否出現(xiàn)尋常型銀屑病(PV)，GPP可分為合并PV的GPP及單純型GPP。我們及其他團(tuán)隊(duì)研究表明IL36RN基因的突變率在單純型GPP中明顯高于合并PV的GPP組，從遺傳學(xué)角度解釋了單純型GPP是區(qū)別于合并PV的GPP一種GPP類型[3,4]。另外有研究表示，IL36RN突變基因型與GPP患者的臨床表型及病情的嚴(yán)重程度有一定關(guān)聯(lián)[5-7]。

本研究擬通過對(duì)107例中國漢族人群GPP進(jìn)行IL36RN直接測(cè)序，并對(duì)其進(jìn)行基因型-臨床表型分析，以探討該基因與GPP臨床表型的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究招募了107例我院2014年1月至2017年1月住院的GPP患者。由我院超過2名有經(jīng)驗(yàn)的皮膚科醫(yī)師診斷。所有的患者表現(xiàn)為原有銀屑病斑片或彌漫性紅斑基礎(chǔ)上膿皰，多數(shù)患者出現(xiàn)高熱、中性粒細(xì)胞及C反應(yīng)蛋白升高。組織病理學(xué)可見典型的表皮中性粒細(xì)胞浸潤形成Kogoj海綿狀膿皰。依據(jù)《赫爾辛基宣言》的原則，本研究得到了山東省皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有患者已簽署知情同意書。

本研究采用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的GPP遺傳流行病學(xué)調(diào)查問卷，內(nèi)容包括一般情況(姓名、年齡、性別、民族、住址等)、GPP發(fā)病年齡、PV發(fā)病年齡(合并PV患者)、誘發(fā)因素、銀屑病家族史。檢查結(jié)果包括體溫、血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白、血沉。選取所有結(jié)果記錄值中的最高值。

1.2 方法

1.2.1 樣本準(zhǔn)備 收集107例中國漢族GPP患者肘靜脈外周血，提取基因組DNA(QuickGene DNA whole blood kit L, KURABO公司,日本)。利用全波長紫外線分光光度計(jì)ND-8000(NanoDrop公司，上海)測(cè)定基因組DNA純度及濃度。將DNA原液標(biāo)化至96孔板中，模板DNA濃度為30 ng/μL。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增及DNA測(cè)序 擴(kuò)增IL36RN基因(參考號(hào)NM_012275.2)的全部4個(gè)編碼的外顯子及其側(cè)翼序列。引物序列見表1。PCR采用12.5 μL體系：Taq master Mix(包含dNTP、Taq酶和緩沖液)6.5 μL,滅活的去離子水ddH2O 5 μL,上下游引物(F+R)各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 min；進(jìn)行以下35個(gè)循環(huán):變性95℃ 40 s,退火(退火溫度見表1)30 s，延伸72℃ 1 min；最后延伸72℃ 10 min。利用ABI 3500XL基因測(cè)序儀(Applied Biosystems，美國)測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果和參考序列同時(shí)輸入到NCBI/BLAST中比對(duì)分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件包22.0版本處理。除了描述性數(shù)據(jù)，定量資料以均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差)或百分比(頻率)表示。攜帶或不攜帶IL36RN基因突變的患者臨床表型兩組間的差異比較，采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。定性資料采用Pearson’s卡方檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 107例GPP患者中包括31例單純型GPP患者和76例合并PV的GPP患者，包括31例兒童型GPP患者和76例成人型GPP患者，GPP患者及各亞組患者的年齡、性別比例、發(fā)病年齡等基本情況如表1所示。

表1 107例GPP患者的基本資料

注：GPP，泛發(fā)性膿皰型銀屑??；PV，尋常型銀屑??；GPP + PV，GPP發(fā)病之前、之后或同時(shí)出現(xiàn)的尋常型銀屑病癥狀；成人型GPP，GPP發(fā)病年齡≥18歲；兒童型GPP，GPP發(fā)病年齡<18歲

2.2 IL36RN基因突變分析 對(duì)107例GPP患者進(jìn)行IL36RN基因測(cè)序，共檢測(cè)到9個(gè)非同義突變位點(diǎn)，總結(jié)見表2。

我們的研究中，共發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新發(fā)突變位點(diǎn)p.Arg10Gln, p.Leu78Pro和p.Tyr89X。突變點(diǎn)p.Tyr89X為終止錯(cuò)義突變位點(diǎn)，在1例單純型GPP患者中檢測(cè)到。應(yīng)用基因突變致病性預(yù)測(cè)工具對(duì)新發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變點(diǎn)p.Arg10Gln和p.Leu78Pro進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，PolyPhen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/bgi.shtml)將2者歸類為有害；SortingIntolerant From Tolerant(SIFT)(http://sift.bii.a-star.edu.sg)將突變點(diǎn)p.Arg10Gln預(yù)測(cè)為無害，將突變點(diǎn)p.Leu78Pro預(yù)測(cè)為有害。

2.2.1 IL36RN基因型-GPP臨床表型關(guān)聯(lián)性分析 根據(jù)基因型將107例GPP患者分為三種亞型：A. 不攜帶IL36RN基因突變的GPP患者(62例)，B. 攜帶雜合IL36RN基因突變的GPP患者(20例)，C. 攜帶隱性IL36RN基因突變(純合突變或復(fù)合雜合突變，即含2個(gè)或2個(gè)以上突變等位基因)的GPP患者(25例)。所有GPP患者的臨床流行病學(xué)特點(diǎn)見表2，利用2×2四格表χ2檢驗(yàn)和Fisher’s精確檢驗(yàn)的分析方法分別比較不攜帶IL36RN基因突變的GPP組(A)與攜帶IL36RN基因突變的GPP組(B + C)，攜帶雜合IL36RN基因突變組(B)與攜帶隱性IL36RN基因突變組(C)的IL36RN基因型-臨床表型之間的關(guān)聯(lián)性，詳細(xì)分析見表3。

表2 107例患者IL36RN突變點(diǎn)總結(jié)

表3 所有GPP患者的臨床表型與IL36RN基因型關(guān)聯(lián)特點(diǎn)

本研究屬于單中心研究，所有GPP患者皆來自山東省或周邊地區(qū)。107例GPP患者的平均年齡為(35.31±18.05)歲，男性多發(fā)，男女比例為1.28：1。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)攜帶或不攜帶IL36RN基因突變組(A vs. B+C)、攜帶雜合或隱性IL36RN基因突變組(B vs. C)患者的年齡、性別分布無差別(P>0.05)。107例GPP患者最常見的誘發(fā)因素為上呼吸道感染，占所有患者的32.7%(35/107)，其余誘發(fā)因素包括季節(jié)改變、妊娠、暴曬、外傷、手術(shù)、藥物等，但伴發(fā)誘發(fā)因素與否與GPP患者是否攜帶IL36RN基因突變無關(guān)。107例GPP患者中只有20.6%的患者有明確的銀屑病家族史，且與GPP患者是否攜帶IL36RN基因突變無關(guān)(P>0.05)。107例GPP患者的平均GPP發(fā)病年齡為(31.31±18.59)歲，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，其在攜帶IL36RN基因突變的GPP患者(27.8±20.31)歲明顯低于不攜帶突變的患者(34.51±17.43)歲(P=0.028)；其在攜帶隱性突變GPP患者(17.92±9.17)歲雖然低于攜帶雜合突變的GPP患者(30.67±21.3)歲，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056)。大部分GPP患者發(fā)病前或發(fā)病過程中曾出現(xiàn)PV癥狀，攜帶IL36RN基因突變的GPP患者合并PV的概率明顯低于不攜帶突變的GPP患者(57.8% vs. 80.6%,P=0.010)，但攜帶隱性突變或攜帶雜合突變的GPP患者合并PV的概率無明顯差異(70% vs. 48%,P=0.138)。接近50%的GPP患者病情曾反復(fù)發(fā)作(發(fā)作>2次)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)攜帶IL36RN基因突變的患者比不攜帶基因突變的患者更易再次發(fā)作(62.2% vs. 38.7%,P=0.016)，且攜帶隱性突變患者的再次發(fā)病率明顯高于攜帶雜合突變患者(84% vs. 35%,P=0.001)。大部分的GPP患者都曾伴發(fā)系統(tǒng)性炎癥(體溫>38℃，白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12×109/L)，但攜帶或不攜帶IL36RN基因突變與GPP患者是否伴發(fā)系統(tǒng)性炎癥無關(guān)(P=0.333)，而攜帶隱性突變患者系統(tǒng)性炎癥發(fā)生率明顯高于攜帶雜合突變患者(100% vs. 50%,P=6.10E-05)。

3 討論

IL36RN編碼一種可溶性分子白細(xì)胞介素36受體拮抗劑(interleukin-36 receptor antagonist，IL36Ra)，主要表達(dá)于皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞。IL36Ra通過拮抗IL36相關(guān)炎癥因子的生物學(xué)效應(yīng)，從而抑制炎癥反應(yīng)的加重。IL36是白介素-1家族的主要成員之一，該家族主要包括IL-36α、IL-36β、IL-36γ等11個(gè)成員[12,13]。小鼠的IL1F5與人類的IL36RN直接同源，當(dāng)將小鼠的IL1F5基因敲除后，小鼠皮膚炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)上膿皰發(fā)作，類似于人類的GPP[14]，證實(shí)了IL36RN是引起GPP發(fā)病的一個(gè)致病基因。2011年，Marrakchi等[2]在9個(gè)突尼斯家族性GPP家族中檢測(cè)到IL36RN基因p.Leu27Pro純合突變，并提出家族性GPP傾向于常染色體隱性遺傳。隨后，多個(gè)學(xué)者在多例散發(fā)GPP患者中檢測(cè)到IL36RN基因突變，并研究發(fā)現(xiàn)IL36RN基因突變引起導(dǎo)致DITRA，炎癥信號(hào)通路激活最終導(dǎo)致GPP的發(fā)生[11,15-17]。迄今為止，在亞洲、歐洲、非洲種群中，共發(fā)現(xiàn)20余個(gè)IL36RN基因突變與GPP的發(fā)病相關(guān)[2,7-11,15,17-19]其中突變點(diǎn)c.115+6T>C在亞洲GPP患者中突變率最高，突變點(diǎn)p.Ser113Leu在歐洲種群中突變率最高。

本研究發(fā)現(xiàn)了3個(gè)未報(bào)道的錯(cuò)義突變位點(diǎn)，即p.Arg10Gln，p.Leu78Pro和p.Tyr89X。其中突變點(diǎn)p.Tyr89X在1例單純型GPP患者中被檢測(cè)到，這例患者曾多次發(fā)病，病情較重，藥物可誘發(fā)發(fā)病，曾被誤診為急性泛發(fā)性發(fā)疹型膿皰病，我們認(rèn)為該患者病情可能與此致病突變有關(guān)。突變點(diǎn)p.Arg10Gln和p.Leu78Pro被蛋白功能預(yù)測(cè)軟件PolyPhen2認(rèn)定為可致破環(huán)性錯(cuò)義突變位點(diǎn)。因此我們認(rèn)為以上突變點(diǎn)具有潛在的致病能力，而其最終導(dǎo)致DITRA的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)2例GPP患者同時(shí)攜帶三個(gè)IL36RN基因雜合突變，這是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最多的突變個(gè)數(shù)。

多個(gè)研究結(jié)果顯示，隱性IL36RN基因突變(純合或復(fù)合IL36RN基因突變)與GPP的發(fā)病相關(guān)[2,11,20]。2015年，Hussain等[5]分析233例GPP患者的IL36RN基因型與GPP臨床表型的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)攜帶IL36RN基因突變患者較不攜帶IL36RN基因突變患者的GPP發(fā)病年齡更低，更易患系統(tǒng)性炎癥，發(fā)病前或發(fā)病過程中發(fā)生PV的概率更低。而攜帶IL36RN基因隱性突變的患者較攜帶IL36RN基因雜合突變的患者平均發(fā)病年齡更低，但伴發(fā)系統(tǒng)性炎癥的概率相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨后，Wang等[7]通過對(duì)66例中國種群兒童單純型GPP進(jìn)行IL36RN直接測(cè)序，分析IL36RN基因型與GPP臨床表型的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)，IL36RN基因突變型與GPP的發(fā)病年齡、次要炎癥皮損征象(融合的膿湖、肛周糜爛、皺襞糜爛)、口服低劑量阿維A治療后復(fù)發(fā)率等臨床表型有關(guān)。另外，M?ssner等[6]通過對(duì)66例歐洲種群的GPP患者進(jìn)行IL36RN基因測(cè)序，分析其基因型-臨床表型關(guān)聯(lián)性發(fā)現(xiàn)IL36RN基因隱性突變型與GPP的發(fā)病年齡臨床表現(xiàn)相關(guān)，但I(xiàn)L36RN基因突變與GPP的發(fā)病年齡無明顯相關(guān)性。基于以上研究結(jié)論各有不同，在此我們對(duì)107例中國漢族GPP進(jìn)行IL36RN基因型與GPP臨床表型關(guān)聯(lián)性分析，認(rèn)為IL36RN基因突變型與GPP患者的發(fā)病年齡、合并PV癥狀的概率、疾病反復(fù)發(fā)作的概率相關(guān)，而IL36RN基因隱性突變型與疾病反復(fù)發(fā)作的概率、疾病合并系統(tǒng)性炎癥的概率相關(guān)，由此我們有理由認(rèn)為IL36RN基因突變與GPP患者的臨床表型存在一定關(guān)系，而攜帶IL36RN隱性突變的患者具有更嚴(yán)重的臨床表型。

綜上所述，IL36RN基因突變不僅與GPP的發(fā)病相關(guān)，與GPP的臨床表型也相關(guān)。