張 波， 崔夢瑤， 張安龍， 劉少卓， 侯銀萍， 王先寶

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人類對能源的需求日益增加.傳統(tǒng)石化能源不斷耗竭導(dǎo)致的能源危機(jī)以及環(huán)境污染問題已經(jīng)成為遏制世界發(fā)展的瓶頸.因此，對可再生、環(huán)保替代能源的開發(fā)研究十分迫切.微藻被認(rèn)為是最具應(yīng)用前景的可再生生物資源之一，它是一類在海洋和陸地都廣泛分布的單細(xì)胞生物，具有光合效率高、生長周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)的特點(diǎn)[1,2]；微藻還具有吸收CO2的能力，并且可以利用各類廢水中N、P等營養(yǎng)進(jìn)行生物量的積累.有研究表明，部分微藻含油量可高達(dá)干重的50%以上[3]，但目前過高的微藻生物柴油生產(chǎn)成本限制了其發(fā)展[4-6].

微藻培養(yǎng)成本占據(jù)微藻生物柴油制備總成本的70%，如何降低微藻的培養(yǎng)成本已經(jīng)成為微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵所在[7].對于這一問題，目前可行的解決辦法是利用廢水培養(yǎng)微藻.生活廢水具有排放量大，N、P含量高，成分復(fù)雜等特點(diǎn).微藻細(xì)胞通過光合作用進(jìn)行生長的同時可以吸收水體中的N、P元素，并使之轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)、脂肪酸等細(xì)胞組分[8,9].以生活廢水培養(yǎng)微藻，為同時實(shí)現(xiàn)廢水的無害化處理、資源化利用以及降低微藻培養(yǎng)成本提供了可能，從而將廢水水質(zhì)凈化與生物質(zhì)生產(chǎn)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)廢水由處理工藝向生產(chǎn)工藝的轉(zhuǎn)變.

這一工藝目前還存在著生物量產(chǎn)率低和藻種資源有限的問題.因此篩選抗污能力好、廢水環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的微藻藻種對廢水培養(yǎng)微藻體系的建立至關(guān)重要.本研究擬針對陜西科技大學(xué)周邊不同水域環(huán)境進(jìn)行微藻的分離篩選，以期獲得可在生活廢水中快速生長的藻種，并考察其在生活廢水中生物量積累的能力和N、P營養(yǎng)的去除能力，并通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對目標(biāo)微藻在混養(yǎng)生長過程中所需的碳源、氮源、磷源濃度進(jìn)行優(yōu)化，以獲得其最佳培養(yǎng)條件.本研究的目的在于篩選出適合在廢水中培養(yǎng)的微藻，提高其生物質(zhì)產(chǎn)量并降低培養(yǎng)成本.

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

(1)主要試劑：硝酸鈉，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

(2)主要儀器：QGZ-500A智能光照培養(yǎng)箱，杭州琦勝科技有限公司；ZHWY-100B經(jīng)典型多振幅軌道搖床，上海珂淮儀器有限公司；OPTIMA XPN-10型低溫超速離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司；Cary 5000型紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)，美國安捷倫公司.

1.2 微藻分離純化

本研究對陜西科技大學(xué)人工湖、陜西科技大學(xué)污水處理站進(jìn)水口、陜西科技大學(xué)前街污水溝、西安工業(yè)大學(xué)人工湖、西安未央湖、西安第五污水處理廠生物處理單元等地進(jìn)行水樣采集，用3層紗布過濾除去水樣中大型浮游生物及懸浮顆粒.對取回實(shí)驗(yàn)室的水樣進(jìn)行鏡檢，若發(fā)現(xiàn)水中藻類數(shù)量較多，可立即直接分離；若發(fā)現(xiàn)藻類數(shù)量較少，應(yīng)向樣品中加入1/2濃度的BG11[10]培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，待藻類增多后再行分離.取適量水樣加在血球計(jì)數(shù)板上，鏡檢計(jì)數(shù)水樣中藻類的密度，按照每個平板50～200個藻類細(xì)胞濃度對水樣進(jìn)行稀釋.取適當(dāng)濃度的水樣100μL均勻涂布于平板上，置于光照培養(yǎng)箱中，待平板長出清晰綠色的藻落后，挑取單藻落在新的平板上劃線，鏡檢確定是否達(dá)到分離目的，重復(fù)劃線直到獲得純種微藻藻種.

進(jìn)行水質(zhì)分析時，將廢水液體樣本3 000 rpm 離心10 min后收集上清液，并適當(dāng)稀釋后參照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第4版)》[11].總氮和總磷濃度的檢測分別采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[12]與鉬酸銨分光光度法[13]進(jìn)行分析.COD的含量采用連華科技多參數(shù)水質(zhì)測定儀5B-6C測定.水質(zhì)分析結(jié)果如表1所示.

1.3 微藻培養(yǎng)

將接種有微藻的平板放在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，三角瓶藻液置于光照下進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng).搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm，光暗時間比為14∶10，溫度與光照強(qiáng)度分別設(shè)定為28 ℃和3 500 lux.

1.4 微藻生長的測定

離心(5 000 rpm,10 min)收獲微藻培養(yǎng)液，將藻泥置于冷凍干燥機(jī)中凍干，對獲得的干藻粉稱其質(zhì)量，以單位體積干重表示其生物量(g/L).

以BG11培養(yǎng)基為參比測定樣品在540 nm紫外光波長下的吸光值.

比生長速率(d-1)=(lnXt-lnX0)/t

(1)

式(1)中：X0為接種后的初始OD(540 nm)，Xt為培養(yǎng)t天后的OD(540 nm)[14].

1.5 生活廢水培養(yǎng)微藻

用于微藻培養(yǎng)的廢水收集于陜西科技大學(xué)前街生活廢水排污口.將廢水用3層紗布過濾除去水樣中大型浮游生物及懸浮顆粒后，稀釋2倍，再將微藻培養(yǎng)液接種，搖床振蕩培養(yǎng).搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm，光暗時間比為14∶10，溫度與光照強(qiáng)度分別設(shè)定為28 ℃和3 500 lux.

1.6 Chlorella sp.營養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化

使用Design-Expert.V8.0.6.1中的Box-Behnken方法進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)，最終得到響應(yīng)值，并進(jìn)行方差分析及最優(yōu)結(jié)果的預(yù)測.以培養(yǎng)基中葡萄糖、硝酸鈉與磷酸氫二鉀的濃度為優(yōu)化因素，在前期單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別設(shè)置三個水平值(表2)，使用Design-Expert.V8.0.6.1設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得到不同因素水平配比的試驗(yàn)組合，試驗(yàn)全部設(shè)置三個平行對照組.根據(jù)此設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，采用葡萄糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀不同配比的培養(yǎng)基對Chlorellasp.進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7天后，收集藻體，得到生物量，計(jì)算得出相應(yīng)生物量積累速率即為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的試驗(yàn)響應(yīng)值.

表2 試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與討論

2.1 分離純化所得微藻

本文從陜西科技大學(xué)人工湖、陜西科技大學(xué)污水處理站進(jìn)水口、陜西科技大學(xué)前街污水溝、西安工業(yè)大學(xué)人工湖、西安未央湖、西安第五污水處理廠生物處理單元等水域采集水樣10份，經(jīng)分離純化得到24株微藻藻株，其中12株可以利用葡萄糖進(jìn)行異養(yǎng)生長.通過顯微鏡鏡檢觀察，所得的藻株多屬于小球藻(Chlorellasp.)、柵藻(Scenedesmussp.)，部分結(jié)果如圖1所示.

(a)、(b)、(c)小球藻 (d)舟型藻 (e)衣藻 (f)、(g)、(h)、(i)柵藻圖1 微藻的顯微形態(tài)(放大400倍)

2.2 不同微藻比生長速率的比較

為了篩選獲得在生活廢水中生物量積累能力強(qiáng)的藻株，將12株可異養(yǎng)藻株接入生活廢水中培養(yǎng)，以Chlorella1068為參照，比較其比生長速率，結(jié)果如圖2所示.不同藻株在廢水中的比生長速率差異較大，其中藻株H (經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為Chlorellasp.，其細(xì)胞形態(tài)如圖1(b)所示)的比生長速率最高，達(dá)到0.17 d-1，生物量產(chǎn)率為109 mg/Ld.

圖2 不同微藻在生活廢水中比生長速率比較

2.3 廢水中小球藻的生長與營養(yǎng)的去除

圖3描述了藻株H (小球藻Chlorellasp.)在生活廢水中的生長狀況.整體而言，小球藻Chlorellasp.在生活廢水中的生長狀況與BG11中相似，接種前2天微藻生長相對緩慢，2～4天內(nèi)進(jìn)入對數(shù)生長階段，培養(yǎng)末期生物量干重達(dá)到1.07 g/L，生物量產(chǎn)率為109 mg/Ld.與此同時，生活廢水可得到良好的凈化 (圖4)，COD、TN、TP的去除率分別達(dá)到39%、88%和93%.

圖3 小球藻Chlorella sp.在生活廢水中的生長曲線

圖4 小球藻Chlorella sp.對生活廢水中COD、TN、TP的去除率

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

為了明確小球藻 (Chlorellasp.) 生物量積累的最佳營養(yǎng)條件，本文以BG11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)面分析方法[15]優(yōu)化了相關(guān)的三個主要營養(yǎng)因素：葡萄糖濃度、硝酸鈉濃度和磷酸氫二鉀濃度.表3顯示了Box-Behnken設(shè)計(jì)中各因素不同水平下小球藻 (Chlorellasp.) 生物量產(chǎn)率的高低.以小球藻 (Chlorellasp.) 生物量產(chǎn)率為響應(yīng)指標(biāo)，利用Design-Expert.V8.0.6.1對結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到響應(yīng)值對編碼自變量(葡萄糖濃度A、硝酸鈉濃度B和磷酸氫二鉀濃度C)的二元多次回歸方程式如式(2)所示：

生物量積累速率=0.70+0.07 3A+0.024B+0.067C+0.035AB+0.072AC+0.001 86BC-0.11A2-0.15B2-0.11C2

(2)

通過表3中Run1與Run4數(shù)據(jù)對比分析可知，硝酸鈉濃度的變化對小球藻(Chlorellasp.)的生長影響不大，與方差分析(ANOVA)中硝酸鈉濃度對微藻的生物量產(chǎn)率影響不顯著的結(jié)果吻合.Run13與Run17結(jié)果對比顯示葡萄糖濃度對微藻生長影響較為明顯，在硝酸鈉濃度與磷酸氫二鉀濃度一致時，在一定范圍內(nèi)隨著葡萄糖濃度增大，微藻的生物量產(chǎn)率增大，表明在小球藻(Chlorellasp.)生長過程中，豐富的碳源對微藻產(chǎn)率至關(guān)重要.因此可以推斷，在利用廢水進(jìn)行微藻培養(yǎng)的過程中，體系中有機(jī)物含量將對微藻產(chǎn)量與COD的降解產(chǎn)生重要影響.Run4與Run16結(jié)果顯示當(dāng)磷酸氫二鉀濃度在一定范圍時(0.01～0.05 g/L)，磷源濃度越大，微藻生物量產(chǎn)率越大，說明磷濃度的變化對微藻生物量產(chǎn)率有較大影響.

生物量積累速率(Y)回歸診斷表明，R2為0.980 3，Adj R2為0.955 0，這說明實(shí)際值與預(yù)測值之間有較好的關(guān)聯(lián)度.信噪比(Adeq Precision)大于4表明模型可用于預(yù)測，此處信噪比為14.853，這表明方程的擬合度與可信度均較高，試驗(yàn)誤差較小，能夠?qū)ε囵B(yǎng)基的優(yōu)化進(jìn)行預(yù)測與分析.

表3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

表4為模型方差分析結(jié)果，模型的顯著性和各變量對響應(yīng)值影響的顯著性水平用F檢驗(yàn)和P值來進(jìn)行判定.概率P的值小于0.01表示影響極顯著，小于0.05表示影響顯著，大于0.05表示影響不顯著.由表4可知，模型顯著且模型失擬項(xiàng)不顯著，說明檢驗(yàn)結(jié)果與模型計(jì)算結(jié)果沒有顯著差異，生長影響較為明顯，在硝酸鈉濃度與磷酸氫二鉀濃度一致時，一定范圍內(nèi)微藻的生物量產(chǎn)率隨著葡萄糖濃度增大而增大.這表明小球藻 (Chlorellasp.) 生長過程中，豐富的碳源對微藻產(chǎn)率至關(guān)重要.因此可以推斷，在利用廢水進(jìn)行微藻培養(yǎng)的過程中，體系中有機(jī)物含量將對微藻產(chǎn)量與COD的降解產(chǎn)生重要影響[16].Run4與Run16的結(jié)果顯示建立的關(guān)于磷的回歸模型顯著，A、C、AC、A2、B2、C2對生物量產(chǎn)率的影響極為顯著；其他項(xiàng)對生物量產(chǎn)率影響不顯著.

表4 模型的方差分析

R2=0.980 3 AdjR2=0.955 0

三維響應(yīng)面圖可以用來直觀地表達(dá)各因素之間的交互作用，并且可以找出最佳的響應(yīng)值.利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件畫出兩個因素與生物量產(chǎn)率之間的響應(yīng)面及等高線分析圖，如圖5所示.

在同一橢圓型的區(qū)域內(nèi)，響應(yīng)值是相同的.等高線圖越密集，與其相對應(yīng)的響應(yīng)面的弧度變化率就越大，說明因素對響應(yīng)值的影響越大；反之，等高線圖越疏松，與其相對應(yīng)的響應(yīng)面的弧度變化率就越小，對應(yīng)因素對響應(yīng)值的影響越小[17].所以，在試驗(yàn)條件范圍內(nèi)對響應(yīng)值影響最大的因素為葡萄糖，其次為磷酸氫二鉀和硝酸鈉.等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩因素的交互作用顯著；而圓形則與之相反.由圖5(c)可以看出等高線圖呈明顯橢圓形狀，說明葡萄糖濃度和磷酸氫二鉀濃度之間存在較大的交互作用.由圖5(e)可以看出等高線呈圓形，說明硝酸鈉與磷酸氫二鉀交互作用較小.在響應(yīng)面的基礎(chǔ)上，根據(jù)Design-Expert.V8.0.6.1軟件中的Optimization分析得出優(yōu)化結(jié)果：以BG11為基礎(chǔ)體系培養(yǎng)小球藻(Chlorellasp.)的最佳條件為6.81 g/L葡萄糖、0.52 g/L硝酸鈉和0.04 g/L磷酸氫二鉀，預(yù)測最大微藻生物量產(chǎn)率為0.737 g/Ld.為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在預(yù)測最佳培養(yǎng)基配方條件下進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到微藻生物量產(chǎn)率為0.71±0.02 g/Ld，與模型預(yù)測相符，證明了模型預(yù)測的準(zhǔn)確性.與優(yōu)化前的BG11培養(yǎng)基中生長量 (0.13 g/Ld) 相比，優(yōu)化后的微藻產(chǎn)率提高了4.5倍.

(a)葡萄糖濃度和硝酸鈉濃度交互作用的等高線圖

(b)葡萄糖濃度和硝酸鈉濃度交互作用的響應(yīng)面圖

(c)葡萄糖濃度和磷酸氫二鉀濃度交互作用的等高線圖

(d)葡萄糖濃度和磷酸氫二鉀濃度交互作用的響應(yīng)面圖

(e)硝酸鈉濃度和磷酸氫二鉀濃度交互作用的等高線圖

(f)硝酸鈉濃度和磷酸氫二鉀濃度交互作用的響應(yīng)面圖圖5 葡萄糖、硝酸鈉和磷酸氫二鉀濃度對小球藻(Chlorella sp.) 生物量積累速率的影響

3 結(jié)論

(1)研究發(fā)現(xiàn)，從陜西科技大學(xué)周邊水域中分離出來的藻株H (小球藻Chlorellasp.) 比生長速率 (0.17 d-1)最高，其生物量產(chǎn)率可以達(dá)到109 mg/Ld，且小球藻Chlorellasp.對生活污水水質(zhì)有著良好的處理效果，COD、TN、TP的去除率分別達(dá)到39%、88%和93%.

(2)在BG11培養(yǎng)基中，通過響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化對小球藻Chlorellasp.生物量積累影響較大的三個因素，結(jié)果顯示其最佳的濃度為：葡萄糖濃度6.81 g/L，硝酸鈉濃度0.52 g/L和磷酸氫二鉀濃度0.04 g/L.小球藻的最大生物量產(chǎn)率提高了4.5倍(0.71±0.02 g/Ld).