趙思怡， 陳 菲， 張鶴山2， 張志飛

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 長沙 410128； 2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 武漢 430064)

紅三葉(TrifoliumpretenseL.)是豆科(Leguminosae)三葉草屬多年生草本植物，原產(chǎn)于小亞西亞及歐洲西南部，在我國大部分省份有栽培[1]。紅三葉側(cè)根發(fā)達(dá)，且根瘤多，耐陰性較強，可用于果樹全園內(nèi)或行間種植[2]，具有維持果園生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性、培肥地力、減輕病蟲雜草危害等作用。而常期噴施含銅殺菌劑或施用規(guī)模畜禽養(yǎng)殖糞便的老果園土壤中銅污染嚴(yán)重[3]。銅是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，也是重金屬污染元素，銅可維持植物正常生理代謝過程，但過量的銅會造成植物水分代謝、光合作用、呼吸作用等各種生理代謝紊亂[4]，抑制植物生長，甚至造成植物死亡。不同植物對銅脅迫的耐受性差異較大，選育高耐銅品種是解決銅污染問題較為經(jīng)濟便捷的措施。本研究以51份紅三葉種質(zhì)資源為研究對象，利用中等脅迫強度的Cu2+進(jìn)行發(fā)芽實驗，比較Cu2+脅迫與對照的發(fā)芽指標(biāo)和根系指標(biāo)差異，對發(fā)芽指標(biāo)和根系指標(biāo)相對值進(jìn)行相關(guān)性分析與主成分分析篩選耐銅性評價指標(biāo)，采用加權(quán)隸屬函數(shù)法和聚類分析對51份紅三葉種質(zhì)資源進(jìn)行耐銅性綜合排序與分類，旨在研究萌發(fā)期紅三葉對高銅濃度的脅迫反應(yīng)，為紅三葉耐銅性品種選育與推廣提供依據(jù)。

表1 51份紅三葉種質(zhì)資源基本信息

編號材料名稱編號材料名稱編號材料名稱編號材料名稱H1CF002082H14CF022175H27CF022190H40CF022224H2CF005803H15CF022176H28CF022197H41CF022227H3CF022150H16CF022177H29CF022199H42CF022228H4CF022153H17CF022178H30CF022201H43CF022229H5CF022156H18CF022179H31CF022202H44CF022231H6CF022163H19CF022180H32CF022204H45CF022232H7CF022165H20CF022181H33CF022207H46CF022234H8CF022167H21CF022183H34CF022211H47CF022235H9CF022168H22CF022185H35CF022212H48CF022236H10CF022170H23CF022186H36CF022217H49CF022321H11CF022171H24CF022187H37CF022219H50CF022324H12CF022172H25CF022151H38CF022222H51CF022325H13CF022174H26CF022189H39CF022223

1 材料與方法

1.1 材 料

51份紅三葉種質(zhì)資源均由湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供(表1)，為來源于俄羅斯的野生種質(zhì)資源。

1.2 試驗方法

選取均勻一致、無病蟲害的種子，以50%的多菌靈可濕性粉劑(山東華陽農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司生產(chǎn))500倍液浸泡種子20 min，用蒸餾水沖洗2～3遍待用。

參照國家牧草種子檢驗規(guī)程——發(fā)芽試驗(GB/T 2930.4-2001)，以前期實驗篩選的中等脅迫強度的Cu2+(CuSO4·5 H2O為銅源，100 mg·L-1)對51份紅三葉種質(zhì)資源進(jìn)行銅脅迫發(fā)芽試驗，以去離子水為對照，每重復(fù)50粒種子，4次重復(fù)。人工氣候箱培養(yǎng)條件為20 ℃恒溫，16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)。每隔24 h統(tǒng)計1次種子發(fā)芽數(shù)，逐日觀察記載發(fā)芽種子數(shù)，以胚根或胚芽突破種皮長于種子長度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，第10天結(jié)束試驗。分別統(tǒng)計種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[5]。

第10天結(jié)束試驗時，每處理隨機選取10株幼苗，清水洗凈，以LA-S系列植物根系分析系統(tǒng)軟件(杭州萬深檢測科技有限公司)進(jìn)行根系掃描分析，統(tǒng)計總根長(mm)、根系體積(mm3)、根系表面積(mm2)、根系平均直徑(mm)、根尖數(shù)(個)等。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

指標(biāo)相對值(%)=(指標(biāo)脅迫處理值/指標(biāo)對照處理值)×100%。

運用SPSS 22分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。根據(jù)9個萌發(fā)指標(biāo)和根系指標(biāo)相對值的相關(guān)性分析和因子主成分分析結(jié)果，篩選耐銅性評價指標(biāo)；以變異系數(shù)賦予權(quán)重，用加權(quán)隸屬函數(shù)法計算綜合隸屬函數(shù)值，對51份紅三葉種質(zhì)資源進(jìn)行耐銅性排序；用系統(tǒng)聚類法進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+脅迫對紅三葉種子萌發(fā)與根系生長的影響

銅脅迫處理的51份紅三葉種質(zhì)材料的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、總根長等5項指標(biāo)顯著低于空白對照(p<0.05)；根系體積、根系平均直徑顯著高于空白對照(p<0.05)；根系表面積、根尖數(shù)與對照無顯著差異。說明100 mg·L-1Cu2+脅迫對紅三葉的萌發(fā)指標(biāo)有顯著抑制作用，但促進(jìn)根系體積、根系平均直徑的發(fā)育。51份紅三葉種質(zhì)材料在銅脅迫下，發(fā)芽指標(biāo)變異系數(shù)波動范圍(64.7%～70.9%)大于對照發(fā)芽指標(biāo)的波動范圍(20.7%～37.2%)；根系指標(biāo)的變異系數(shù)相對較小。表明在100 mg·L-1Cu2+脅迫下紅三葉發(fā)芽指標(biāo)的品種間差異大于根系間差異。

表2 51份紅三葉種質(zhì)資源不同處理下觀測指標(biāo)值的比較

觀測指標(biāo) 銅脅迫組 對照組 均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)/%最大值最小值均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)/%最大值最小值發(fā)芽勢/%34.0b24.170.983.51.553.7a12.723.686.521.0發(fā)芽率/%37.3b24.164.783.51.560.5a12.520.791.529.5發(fā)芽指數(shù)30.6b21.770.778.72.950.2a15.330.580.516.8活力指數(shù)99.4b67.067.4285.612.9248.2a92.437.2459.868.9總根長/mm3.5b0.721.25.02.34.9a0.714.66.43.5根系表面積/mm27.2a1.723.610.94.47.2a1.621.710.95.0根系體積/mm31.2a0.428.22.10.70.9b0.333.01.70.5根系平均直徑/mm0.7a0.06.10.70.60.5b0.112.50.70.3根尖數(shù)/個1.1a0.214.01.51.01.2a0.213.61.71.0

注：同一行的不同小寫字母表示水平差異顯著(p<0.05)。

表3 各指標(biāo)相對值相關(guān)性分析

觀測指標(biāo) 相對發(fā)芽勢相對發(fā)芽率相對發(fā)芽指數(shù)相對活力指數(shù)相對總根長相對根系表面積相對根系體積相對根系平均直徑相對發(fā)芽率0.951??相對發(fā)芽指數(shù)0.961??0.950??相對活力指數(shù)0.879??0.870??0.921??相對總根長-0.384?-0.431-0.376??-0.059相對根系表面積-0.514??-0.571??-0.501??-0.2410.926??相對根系體積-0.541??-0.603??-0.527??-0.318?0.805??0.964??相對根系平均直徑-0.513??-0.565??-0.509??-0.477??0.294?0.611??0.766??相對根尖數(shù)-0.148-0.107-0.156-0.0150.453??0.434??0.401??0.121

2.2 指標(biāo)相對值的相關(guān)性分析

51份紅三葉種質(zhì)資源發(fā)芽、根系等9項指標(biāo)在銅脅迫和空白對照的相對值進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相對發(fā)芽勢除與相對根尖數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性外，與其他7項指標(biāo)均有極限著或顯著相關(guān)性關(guān)系(p<0.01或p<0.05)；相對根系體積、相對根系平均直徑與4項發(fā)芽指標(biāo)相對值間均存在兩兩極限著負(fù)相關(guān)(p<0.01)，與其他3項根系指標(biāo)相對值間存在極限著正相關(guān)(p<0.01)?？傮w來看各指標(biāo)的相對值間相互關(guān)聯(lián)程度較高。

2.3 耐銅性評價指標(biāo)的篩選

對51份紅三葉種質(zhì)資源發(fā)芽、根系等9項指標(biāo)在銅脅迫和空白對照的相對值進(jìn)行因子主成分分析(表4、表5)。結(jié)果表明，前2個成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到82.589%，且特征值都大于1，第一主成分特征值為5.411，貢獻(xiàn)率為60.126%，對應(yīng)特征向量中載荷較大的3個指標(biāo)是相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽指數(shù)。第二主成分特征值為2.022，貢獻(xiàn)率為22.463%，對應(yīng)特征向量中載荷較大的2個指標(biāo)為相對活力指數(shù)和相對總根長。根據(jù)指標(biāo)相關(guān)性分析和因子主成分分析結(jié)果，選擇在第一主成分或第二主成分中特征值較大，且具有代表性的指標(biāo)作為紅三葉耐銅綜合評價指標(biāo)，分別為：相對發(fā)芽率、相對活力指數(shù)和相對總根長。

表4 3個主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率

主成分特征值貢獻(xiàn)率/%累積貢獻(xiàn)率/%Ⅰ5.41160.12660.126Ⅱ2.02222.46382.589

表5 各因子載荷矩陣

觀測指標(biāo) 主成分ⅠⅡ相對發(fā)芽勢0.8890.378相對發(fā)芽率0.9150.337相對發(fā)芽指數(shù)0.8890.398相對活力指數(shù)0.7370.634相對總根長-0.6610.638相對根系表面積-0.8190.544相對根系體積-0.8480.459相對根系平均直徑-0.7170.045相對根尖數(shù)-0.3310.538

2.4 紅三葉耐銅性隸屬函數(shù)綜合評價以及聚類分析

51份紅三葉種質(zhì)資源的相對發(fā)芽率、相對活力指數(shù)、相對總根長等3項指標(biāo)為紅三葉耐銅性評價指標(biāo)，以其變異系數(shù)賦予權(quán)重分別為0.41、0.43和0.16；以此計算綜合隸屬函數(shù)值(D值)(表6)。采用歐氏距離法對51份種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，51份紅三葉在歐氏距離5處可分為3個類群。其中第1類群包括編號為H 24、H 15、H 48、H 10、H 11和H 8等6份種質(zhì)資源，其耐銅性綜合隸屬函數(shù)值較大，耐銅性最強。第2類群耐銅性居中，包括H 23、H 3和H 21等19份種質(zhì)資源。第3類群耐銅性較弱，有H 16、H 45和H 47等26份種質(zhì)資源。

表6 51份紅三葉種質(zhì)資源耐銅性隸屬函數(shù)分析

編號指標(biāo)隸屬函數(shù)值相對發(fā)芽率相對活力指數(shù)相對總根長綜合隸屬函數(shù)值排序H10.5330.4000.3340.44420H20.3840.2210.1550.27729H30.6020.6270.4940.5968H40.5450.4670.5120.50615H50.4310.1740.0000.25234H60.5060.2960.2170.36925H70.7150.3780.0290.46118H80.7060.7720.4460.6936H90.5880.4480.2770.47817H100.9630.8490.1830.7894H110.7250.7610.4330.6945H120.6000.3200.0070.38423H130.5970.4210.1470.44919H140.6880.4090.1320.47916H151.0000.9220.1060.8232H160.3960.2740.1550.30526H170.6840.5150.4420.57210H180.6830.5520.1110.53513H190.4930.6560.3960.54812H200.5520.5450.2880.50714H210.6800.5570.4670.5939H220.4460.4000.1820.38424H230.5580.7010.4380.6007H240.8940.9530.3000.8241H250.7170.5600.1350.55611H260.1490.4911.0000.43221H270.2570.1240.3830.22037H280.3500.1220.1990.22836H290.1570.0490.1670.11247H300.2470.2460.3340.26032H310.0750.0230.1660.06750H320.1490.1380.2880.16744H330.0470.0000.2230.05551H340.0730.0710.6150.15945H350.1030.1020.5060.16743H360.1000.1110.6090.18641H370.1470.1230.5650.20339H380.0600.0260.2460.07549

續(xù)表6

編號指標(biāo)隸屬函數(shù)值相對發(fā)芽率相對活力指數(shù)相對總根長綜合隸屬函數(shù)值排序H390.0460.0480.5950.13546H400.2100.1790.5660.25433H410.1840.1810.7460.27330H420.1150.1460.4340.17942H430.2900.3620.9700.43022H440.0000.0310.4990.09348H450.1270.2950.7830.30427H460.1050.1310.6990.21138H470.1380.2160.9320.29828H480.6571.0000.7030.8123H490.1520.1670.3800.19540H500.2580.2280.3890.26631H510.2520.1410.4870.24235權(quán)重0.410.430.16

圖1 51份紅三葉種質(zhì)資源耐銅性聚類

3 討 論

3.1 耐銅性鑒定指標(biāo)的篩選及綜合評價方法

植物耐受銅脅迫的抗性機理非常復(fù)雜，可能表現(xiàn)為多種生理過程的綜合反應(yīng)[6]，多指標(biāo)的綜合鑒定極為重要。多指標(biāo)鑒定已成為鹽[7]、旱[8]、堿[9]、重金屬[10-11]等非生物脅迫抗性鑒定的共識。劉紅云[12]南粳39的根系凈伸長量為指標(biāo)對167個水稻品種耐銅性進(jìn)行篩選。張黛靜等[13]利用根長相對值、株高相對值、相對根系活力、總根長相對值、根體積相對值和根表面積相對值等6個生長生理指標(biāo)的相對值進(jìn)行平均隸屬函數(shù)和聚類分析，將37個小麥品種分為強、中、弱三大類。本研究利用主成分分析和相關(guān)性分析，從9個指標(biāo)中篩選出3個指標(biāo)(相對發(fā)芽率、相對活力指數(shù)和相對總根長)；并根據(jù)變異系數(shù)求出各指標(biāo)權(quán)重，進(jìn)行隸屬函數(shù)值計算，再利用聚類分析將51份紅三葉種質(zhì)資源分為3個耐銅性類群。本研究在較全面了解紅三葉銅脅迫條件下的萌發(fā)特性和根系生長特性的前提下，利用統(tǒng)計學(xué)方法對眾多材料進(jìn)行耐銅性分類，較為準(zhǔn)確簡捷，適用于大量材料耐銅性的初級篩選。

3.2 萌發(fā)期植物耐銅性特性

植物萌發(fā)期對外界環(huán)境較為敏感，對萌發(fā)期植物材料進(jìn)行抗性鑒定可操作性強、周期短、效率高[9，12]。銅主要積累在草本植物的根部，從而減少對地上部分的毒害作用[14-16]，根部危害較地上部更為明顯，危害發(fā)生時間更早；但不同植物種間以及同一植物的不同品種間對銅的耐受能力差異較大。與紅三葉同屬植物白三葉(T.repensL.)可在質(zhì)量比重1∶5的尾礦和蒸餾水的浸提液中萌發(fā)，但發(fā)芽率和胚根長度顯著下降，銅尾礦中銅含量嚴(yán)重超過《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 15618-1995)三類標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到3 536.79 mg·kg-1。說明白三葉對銅脅迫的耐受能力較強，可作為銅尾礦修復(fù)的先鋒植物[17]。白三葉、紅豆草(OnobrychisviciaefoliaScop.)、檸條(CaraganakorshinskiiKom.)、胡枝子(LespedezabicolorTurcz.)等4個豆科植物的銅脅迫發(fā)芽試驗結(jié)果表明，在CCu2+≤300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，紅豆草的發(fā)芽率逐漸增加；CCu2+>300 mg·L-1后，隨著CCu2+濃度增加，發(fā)芽率顯著下降；而白三葉和檸條的發(fā)芽率在CCu2+≤300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，呈不規(guī)律變化。胡枝子的發(fā)芽率始終隨著CCu2+>100 mg·L-1的濃度增加而下降。4種豆科牧草在CCu2+≤300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，根系受影響無明顯規(guī)律。而CCu2+>300 mg·L-1后，根系受到明顯抑制，500 mg·L-1Cu2+時，僅紅豆草仍有根長，其他3種牧草已無根系發(fā)育[18]。相比較而言，蔬菜種子黃瓜(CucumissativusL.)和蘿卜(RaphanussativusL.)較豆科牧草的耐銅性差。黃瓜和蘿卜分別在80、100 mg·L-1Cu2+時，發(fā)芽率受到抑制；在60、40 mg·L-1Cu2+時根長受到抑制[19]。CCu2+≥80 mg·L-1時對大田作物小麥(TriticumaestivumL.)種子發(fā)芽及幼苗苗長、根長等有抑制作用[20]。本研究中用100 mg·L-1Cu2+脅迫時參試的51個紅三葉種質(zhì)資源的萌發(fā)指標(biāo)和根長都有顯著抑制作用(p<0.05)，但根系增粗，可見紅三葉萌發(fā)期的耐銅性也較強。

4 結(jié) 論

100 mg·L-1Cu2+脅迫對紅三葉的萌發(fā)指標(biāo)和根長有顯著抑制作用(p<0.05)，但促進(jìn)根系增粗；根據(jù)9個指標(biāo)相對值的兩兩相關(guān)性分析和主成分分析篩選出相對發(fā)芽率、相對活力指數(shù)和相對總根長作為紅三葉萌發(fā)期耐銅性綜合評價指標(biāo)，51份紅三葉種質(zhì)資源分為三大類：H 24、H 15、H 48、H 10、H 11和H 8等6份為耐銅性紅三葉種質(zhì)資源，H 23、H 3和H 21等19份為中等耐銅紅三葉種質(zhì)資源，H 16、H 45和H 47等26份為不耐銅紅三葉種質(zhì)資源。