高素燕 呂敬剛　焦荻　商紀(jì)鵬　焦定量　黃亞杰

摘? ? 要：為建立辣椒自然游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系，以32個(gè)辣椒品種為試材，研究基因型（CL-1～CL-32）、基本培養(yǎng)基（MS、Nitsch and Nitsch、NLN、B5）、激素配比（ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 0.8 mg·L^-1、ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1、ZT 1.0 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1、ZT 1.5 mg·L^-1+IAA 1.5 mg·L^-1）、活性炭添加量（0.1，0.5，0.8，1.0 g·L^-1）對(duì)辣椒小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，基因型是辣椒小孢子胚狀體誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素，供試的32個(gè)基因型中有18個(gè)誘導(dǎo)成功，誘導(dǎo)成功率56.25%，其中F1代誘導(dǎo)成功率達(dá)到66.67%，而自交系誘導(dǎo)成功率為0，各基因型中以CL-14誘導(dǎo)率最高，達(dá)到29.2%;不同基因型最適培養(yǎng)基不同，5個(gè)基因型（CL-4，CL-8，CL-10，CL-12，CL-14）中CL-4、CL-12、CL-14均以Nitsch and Nitsch為基本培養(yǎng)基添加適量激素誘導(dǎo)胚狀體最佳;不同基因型的適宜激素濃度配比不同，3個(gè)基因型（CL-4、CL-8、CL-14）中CL-8、CL-14以添加0.5 mg·L^-1 ZT和1.0 mg·L^-1

IAA效果最好;適量添加活性炭可提高小孢子胚誘導(dǎo)率，CL-4、CL-8、CL-14分別以添加0.8，0.5，0.5 g·L^-1誘導(dǎo)效果最好。

關(guān)鍵詞：辣椒;小孢子培養(yǎng);花藥培養(yǎng);胚狀體;單倍體

中圖分類號(hào)：S641.3 ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.04.003

Studies on Embryoid Induction of Shed-microspore Culture in Pepper （Capsicum annuum L.）

GAO Suyan1，2，3，4， LYU Jinggang1，2，3，4， JIAO Di1，2，3，4， SHANG Jipeng1，2，3，4， JIAO Dingliang1，2，3，4， HUANG Yajie1，2，3，4

（1. Tianjin Kernel Vegetable Research Institute， Tianjin 300381， China; 2.State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation， Tianjin 300381， China; 3.Tianjin Key Laboratory of Vegetable Genetics and Breeding Enterprise， Tianjin 300381， China; 4.Tianjin Vegetable Research Center， Tianjin 300381， China）

Abstract： To establish the shed-microspore culture technique system in pepper， the experiment was conducted with 32 pepper varieties as materials， the effects of genotypes（CL-1～CL-32）， culture medium （MS， Nitsch and Nitsch， NLN， B5）， hormones （ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 0.8mg·L^-1， ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1， ZT 1.0 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1， ZT 1.5 mg·L^-1+IAA 1.5 mg·L^-1）， active charcoal （0.1， 0.5， 0.8， 1.0 g·L^-1） on microspore embryos induction were studied. The results showed that genotype was the key factor for microspore embryoid induction in pepper， 18 of 32 genotypes were embryonic， and the induction success rate was 56.25%; the induction success rate of F1 generation was 66.67%， while that of inbred lines were 0; the induction rate of CL-14 was the highest （29.2%）. The optimum medium for different genotypes was different， Nitsch and Nitsch was best for CL-4， CL-12， CL-14 in 5 genotypes （CL-4， CL-8， CL-10， CL-12， CL-14）. In 3 genotypes （CL-4， CL-8， CL-14）， adding 0.5 mg L-1 ZT and 1.0 mg L-1 IAA was suitable for CL-8， CL-14 to produce embryos successfully. Adding activated carbon could improve the induction rate of microspore embryos， in which CL-4， CL-8 and CL-14 had the best induction effect by adding 0.8， 0.5， 0.5 g·L^-1， respectively.

Key words： pepper; microspore culture; anther culture; embryo; haploid

辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒屬一年生或多年生草本植物，在明末傳入我國(guó)，并被廣泛種植。據(jù)2017年中國(guó)蔬菜流通協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)辣椒栽培面積占世界總面積的35%，總產(chǎn)量占世界的46%（數(shù)據(jù)來(lái)源于2017年遵義第二屆國(guó)際辣椒博覽會(huì)新聞發(fā)布會(huì)），辣椒產(chǎn)業(yè)已成為國(guó)內(nèi)最大的蔬菜產(chǎn)業(yè)。

單倍體培養(yǎng)技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)獲得純系、縮短育種周期，受到育種家的普遍重視。早在1973年國(guó)內(nèi)外就已經(jīng)有通過(guò)花藥培養(yǎng)獲得辣椒單倍體植株[1-2]的報(bào)道，之后多位研究者對(duì)培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn)[3-6]，并利用該技術(shù)選育出海花系列辣（甜）椒品種[7-9]。隨著小孢子培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始進(jìn)行辣椒的游離小孢子培養(yǎng)的探索并成功獲得胚狀體[10-13]。但游離小孢子胚狀體誘導(dǎo)率極低，雖然經(jīng)過(guò)改良培養(yǎng)基、小孢子預(yù)處理等方法的改進(jìn)，仍不能達(dá)到理想效果。利用固液雙層培養(yǎng)方法（小孢子散出培養(yǎng)法或自然游離法）既可有效減少花藥培養(yǎng)過(guò)程中易褐化的問(wèn)題，也可減少機(jī)械游離對(duì)小孢子的傷害，該方法國(guó)內(nèi)外均有成功報(bào)道[14-17]，但多應(yīng)用于甜椒，并且誘導(dǎo)頻率較低，因此繼續(xù)對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化，提高胚狀體誘導(dǎo)率，獲得雙單倍體（DH）植株及DH系才能使該技術(shù)早日應(yīng)用于辣椒育種中。

本研究通過(guò)對(duì)不同類型辣椒進(jìn)行自然游離小孢子的培養(yǎng)，分析影響小孢子胚狀體誘導(dǎo)的各種因素，旨在總結(jié)出適合辣椒單倍體誘導(dǎo)的培養(yǎng)方法，提高辣椒小孢子胚狀體誘導(dǎo)率。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為32個(gè)辣椒雜交一代及自交系，來(lái)源于天津科潤(rùn)蔬菜研究所辣椒課題組，于2018年4月定植于天津市農(nóng)科院武清創(chuàng)新基地的塑料大棚中，類型包括羊角椒、牛角椒、螺絲椒、線椒;其中雜交一代品種27個(gè)，自交系5個(gè);供試材料及主要特性見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

小孢子培養(yǎng)方法參考Supena[15]，并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。具體操作過(guò)程如下：從處于始花期至盛花期的辣椒植株上選取處于單核靠邊期的花蕾置于4 ℃冰箱中預(yù)處理1～2 d;在超凈工作臺(tái)上將花蕾用70%酒精浸泡30 s，5% NaClO滅菌15 min，無(wú)菌水沖洗3～4次，用無(wú)菌濾紙吸干花蕾表面水分;用無(wú)菌刀片將花蕾剖開(kāi)取出花藥并將花藥基部的花絲去除干凈，之后接種于裝有固液雙層培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑60 mm）中，每皿接種10～12個(gè)花藥，每個(gè)處理接種3皿，設(shè)3次重復(fù);置于9 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)1周，之后轉(zhuǎn)入25 ℃暗培養(yǎng)3～5周后再轉(zhuǎn)入光照下培養(yǎng)。

具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下。（1）基因型：上述32份材料在固體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）基本培養(yǎng)基處理：以CL-4、CL-8、CL-10、CL-12、CL-14為材料，在MS、Nitsch and Nitsch（NN）、NLN、B5液體培養(yǎng)基加MS固體培養(yǎng)基上采用自然游離培養(yǎng)法進(jìn)行單倍體培養(yǎng)。（3）外源激素處理：以CL-4、CL-8、CL-14為試材，在Nitsch and Nitsch（NN）液體培養(yǎng)基加MS固體培養(yǎng)基上采用自然游離培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置4個(gè)激素組合處理（ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 0.8 mg·L^-1，ZT 0.5 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1，ZT 1.0 mg·L^-1+IAA 1.0 mg·L^-1，ZT 1.5 mg·L^-1+IAA 1.5 mg·L^-1），以不添加激素作為對(duì)照（CK）。（4）活性炭（AC）處理：以CL-4、CL-8、CL-14為試材，培養(yǎng)基與外源激素處理相同，在下層MS固體培養(yǎng)基添加活性炭，濃度設(shè)置為0.1，0.5，0.8，1.0 g·L^-1，以不添加活性炭處理作為對(duì)照（CK）。

從接種30 d開(kāi)始，每15 d調(diào)查1次胚狀體發(fā)生數(shù)，連續(xù)調(diào)查3次，以胚狀體數(shù)最多的1次計(jì)算胚狀體誘導(dǎo)率。胚狀體誘導(dǎo)率=（胚狀體數(shù)/接種花藥總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程的形態(tài)觀察

將處于單核靠邊期的花藥接種于固液雙層培養(yǎng)基（固體MS+液體NN）中進(jìn)行培養(yǎng)，大約5周后可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的胚狀體（圖1A）;解剖鏡下觀察發(fā)現(xiàn)以球形、魚(yú)雷形胚狀體為主（圖1B），之后部分胚狀體繼續(xù)發(fā)育成子葉形胚狀體;培養(yǎng)8周后，子葉形胚狀體開(kāi)始萌發(fā)并形成再生植株（圖1C、圖1D）。

2.2 基因型對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

在多種作物的單倍體培養(yǎng)研究中，基因型均是關(guān)鍵影響因素[18-20]，辣椒小孢子胚狀體誘導(dǎo)也同樣受基因型影響較大。從表2可以看出，在供試的32個(gè)基因型中，有18個(gè)基因型誘導(dǎo)胚狀體，誘導(dǎo)成功率為56.25%;羊角椒誘導(dǎo)成功率66.67%、螺絲椒誘導(dǎo)成功率100%、線椒誘導(dǎo)成功率33.33%;雜交一代誘導(dǎo)成功率為66.67%，自交系未能誘導(dǎo)出胚狀體。誘導(dǎo)率最高的基因型為CL-14，誘導(dǎo)率達(dá)到29.20%。因此，基因型是辣椒小孢子胚狀體誘導(dǎo)的重要因素，不同類型辣椒其誘導(dǎo)結(jié)果也不同。

2.3 基本培養(yǎng)基對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

選擇5個(gè)誘導(dǎo)率較高的基因型繼續(xù)進(jìn)行基本培養(yǎng)基的篩選。由表3可知，以MS、NLN、Nitsch and Nitsch（NN）、B5為基本培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)胚狀體;CL-4、CL-12、CL-14以Nitsch and Nitsch（NN）為基本培養(yǎng)基胚狀體誘導(dǎo)效果較好，誘導(dǎo)率較高，并且畸形胚或死亡胚數(shù)量較少，而CL-8、CL-10最適培養(yǎng)基為NLN，說(shuō)明基本培養(yǎng)基的選擇會(huì)影響辣椒小孢子胚狀體誘導(dǎo)，不同基因型辣椒最適培養(yǎng)基不同。

2.4 激素配比對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

以CL-4、CL-8、CL-14為試材，研究在Nitsch and Nitsch（NN）上層液體培養(yǎng)基中添加不同濃度配比的ZT、IAA對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響，以不添加激素為對(duì)照。由表4可知，添加激素可顯著提高辣椒小孢子胚狀體的誘導(dǎo)率，其中0.5 mg·L^-1 ZT+1.0 mg·L^-1IAA的激素組合分別使CL-8、CL-14胚狀體誘導(dǎo)率提高1.2和1.4倍，0.5 mg·L^-1 ZT+0.8 mg·L^-1IAA的激素組合使CL-4胚狀體誘導(dǎo)率提高2.2倍，因此，不同基因型最適激素濃度配比也不相同。

2.5 活性炭對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響

以CL-4、CL-8、CL-14為試材，在下層固體培養(yǎng)基中添加不同濃度活性炭，研究活性炭對(duì)辣椒小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響。由表5可知，下層固體培養(yǎng)基中添加一定濃度的活性炭可提高小孢子胚誘導(dǎo)率，隨著活性炭濃度增加，誘導(dǎo)率呈先增加后下降的趨勢(shì)，CL-4、CL-8、CL-14分別以添加0.8，0.5，0.5 g·L^-1活性炭誘導(dǎo)效果最好。

3 結(jié)論與討論

目前，有關(guān)辣椒小孢子培養(yǎng)方式已有大量研究，主要是采用機(jī)械游離[12]和自然釋放[14]2種方法獲得游離小孢子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)辣椒小孢子在機(jī)械積壓過(guò)程中易造成損傷從而影響誘導(dǎo)率，而采用固液雙層培養(yǎng)辣椒花藥使小孢子自然游離既減少了對(duì)小孢子的損傷，也避免了花藥培養(yǎng)過(guò)程中易褐化、易形成愈傷等問(wèn)題[16]。本試驗(yàn)采用固體MS培養(yǎng)基成功獲得18個(gè)基因型辣椒小孢子胚狀體，最高誘導(dǎo)率為29.2%（CL-14），在固液雙層Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基添加適宜濃度激素，CL-14誘導(dǎo)率可提高至32.6%，說(shuō)明通過(guò)固液雙層培養(yǎng)基進(jìn)行辣椒自然游離小孢子培養(yǎng)可以獲得較高的胚誘導(dǎo)率，這一結(jié)果與Supena[14-15]、Esin[16]等人的研究報(bào)道相符。

培養(yǎng)基中添加激素可提高胚狀體誘導(dǎo)率，但其效果因激素種類和濃度不同而不同，甚至不添加激素的培養(yǎng)基也可獲得胚狀體[17]。本試驗(yàn)結(jié)果亦表明，培養(yǎng)基中添加激素可提高胚狀體誘導(dǎo)率，但不同基因型最適激素濃度不相同。

活性炭對(duì)小孢子培養(yǎng)的影響表現(xiàn)在兩方面，一方面有利于吸收有害物質(zhì)而促進(jìn)胚狀體的形成，另一方面也會(huì)吸收激素等有益物質(zhì)而妨礙胚狀體的形成。在單純固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基研究中，有的研究發(fā)現(xiàn)活性炭有利于小孢子胚的誘導(dǎo)[21]，有的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)不添加活性炭會(huì)獲得較多胚狀體[22]。本試驗(yàn)將活性炭添加于下層固體培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示在一定濃度范圍內(nèi)有利于胚狀體發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

[1]王玉英，孫敬三，王敬駒，等.小黑麥和辣椒花粉植株的誘導(dǎo)[J].中國(guó)科學(xué)，1973（16）：104-107.

[2]GEORGE L， NARAYANASWAMY S. Haploid Capsicum through experimental androgenesis[J].Protoplasma， 1973， 78： 467-470.

[3]KELL K， SVEN B A. Effects of donor plant temperature， photoperiod， and age on anther culture response of Capsicum annuum L.[J].Euphytica， 1993， 67： 105-109.

[4]MITYKO J， FARI M. Problems and results of doubled haploid plant production in pepper （Capsicum annuum L.） via anther and microspore culture[J]. Acta horticulturae， 1997， 447： 281-288.

[5]ERCAN N， SENSOY F A， SENSOY S. Influence of growing season and donor plant age on anther culture response of some pepper cultivars （Capsicum annuum L.）[J].Sci hortic， 2006， 110： 16-20.

[6]王立浩，張寶璽，郭家珍，等.辣椒花藥培養(yǎng)中若干影響因素的研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31（2）：199-204.

[7]李春玲，蔣鐘仁.甜椒花培新品種‘海花三號(hào)的育成[J].園藝學(xué)報(bào)，1990，17（1）：39-44， 82.

[8]張樹(shù)根，沈火林，蔣鐘仁，等.辣椒花藥培養(yǎng)單倍體育種技術(shù)研究進(jìn)展[J].辣椒雜志，2006（3）：1-5， 8.

[9]PAUK J， LANTOS C， SOMOGYI G， et al. Tradition， quality and biotechnology in Hungarian spice pepper （Capsicum annuum L.） breeding[J]. Acta agron hung， 2010， 58（3）： 259-266.

[10]GEMES J A， KRISTOF Z， VAGI P， et al. In vitro anther and isolated microspore culture as tool in sweet and spice pepper breeding[J]. Acta horticulturae， 2009， 829： 61-64.

[11]BUYUKALACA S， COMLEKCIOGLU N， ABAK K， et al. Effects of silver nitrate and donor plant growing conditions on production of pepper（Capsicum annuum L.） haploid embryos via anther[J].Eur j hortic sci， 2004， 69： 206-209.

[12]LANTON C， JUHASZ A G， VAGI P， et al. Androgenesis induction in microspore culture of sweet pepper （Capsium annuum L.） [J].Plant biotechnol rep， 2012， 6： 123-132.

[13]成研，巫東堂，馬蓉麗，等.不同游離方式辣椒小孢子的胚胎發(fā)生[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（7）： 705-708.

[14]SUPENA E D J， SUHARSONO S， JACOBSEN E， et al. Successful development of a shed-microspore culture protocol for doubled haploid production in Indonesian hot pepper ?（Capsicum annuum L.） [J].Plant cell rep， 2006b， 25： 1-10.

[15]SUPENA E D J， CUSTERS J B M. Refinement of shed-microspore culture protocol to increase embryos production in hot pepper（Capsicum annuum L.）[J].Sci hortic， 2011， 130： 769-774.

[16]ESIN A， TOLGA Y， NEDIM M， et al. Comparison of different androgenesis protocols for doubled haploid plant production on ornamental pepper（Capsicum annuum L.）[J].Turk journal of biology， 2016， 40： 944-954.

[17]黃亞杰，李素文，肖瑜，等.辣椒花藥培養(yǎng)的初步研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（7）：112-115， 125.

[18]曹鳴慶，李巖，劉凡.基因型和供體植株生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1993，8（4）：1-6.

[19]戴希剛，施雪萍，包滿珠.基因型與培養(yǎng)條件對(duì)羽衣甘藍(lán)小孢子胚胎發(fā)生的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，2012，48（11）：1113-1119.

[20]張玉苗.不同茄子材料小孢子脫分化及影響因子研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[21]李春玲，佟曦然，朱至清，等.辣（甜）椒游離小孢子培養(yǎng)中的雄核發(fā)育和胚胎發(fā)生[J].園藝學(xué)報(bào)，2008，35（11）：1613-1620.

[22]韓陽(yáng)，葉雪凌，馮輝.大白菜小孢子培養(yǎng)影響因素研究[J].中國(guó)蔬菜，2006（7）：16-18.