李 春 吳 桐 秦大蓮 于 紅 謝 翔 李 雪 袁 青

(西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，瀘州646000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)簡稱金葡菌，為臨床常見病原菌，能產(chǎn)生多種毒素、酶及抗原蛋白，具有較強(qiáng)的致病性，能引起皮膚、呼吸道嚴(yán)重感染及敗血癥[1]。抗生素是長期以來治療金黃色葡萄球菌感染的主要有效手段。但在1961年從臨床上首次分離出致病性強(qiáng)、傳播途徑廣的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)后，隨著世界范圍內(nèi)抗生素、消毒劑濫用以及抗生素殘留向環(huán)境釋放的情況越來越嚴(yán)重，其耐藥范圍日益擴(kuò)大，耐藥程度日益嚴(yán)重，MRSA成為全球院內(nèi)感染的首要病原菌，也有人將其稱為“超級細(xì)菌”。 MRSA感染同乙型肝炎、艾滋病(AIDS)并稱為世界三大感染性疾病[2]。所謂“最后一線用藥”的萬古霉素是目前用于治療MRSA感染的首選藥，但也由于抗生素的濫用，最終導(dǎo)致萬古霉素中間體金黃色葡萄球菌(VISA)菌株的出現(xiàn)，到2002和2004年出現(xiàn)了高度耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌(VRSA)。因此，研發(fā)新的抗金黃色葡萄球菌的藥物或者疫苗迫在眉睫，發(fā)現(xiàn)新的有效藥物或者疫苗的靶點已經(jīng)成為了目前國際研發(fā)的新熱點[3]。

金黃色葡萄球菌分泌的多種毒力因子決定了細(xì)菌的致病性，包括α-溶血素(α-HL)、殺白細(xì)胞素(PVL)、酚溶性調(diào)節(jié)蛋白(PSMs)、γ-溶血素等。其中α-HL是一種細(xì)胞外毒素，也是主要的毒力因子之一。α-HL的前體由319個氨基酸組成，其前體通過聚集形成了一個相對分子質(zhì)量為2.32×105的七聚體，然后再通過折疊形成一個β桶狀的跨膜區(qū)域，此區(qū)域為1.4×10-9m，它可以允許分子量小于2 kD的分子通過，如鉀離子、鈉離子，從而引起靶細(xì)胞的壞死[4]。Bubeck等[5]研究表明敲除α-HL基因后，感染金黃色葡萄球菌的肺炎小鼠模型的致死率顯著降低。芝加哥大學(xué)學(xué)者采用雜交瘤技術(shù)制備出抗α-溶血素單克隆抗體(MAbs)進(jìn)行被動免疫實驗，結(jié)果表明MAbs在體外可預(yù)防人類肺泡上皮細(xì)胞(A549)受到損傷，并且接受免疫的小鼠在感染金黃色葡萄球菌后死亡率有顯著降低[6]。雖然單克隆抗體具有結(jié)構(gòu)均一、純度高、特異性強(qiáng)、效價高、血清交叉反應(yīng)少、制備成本低等多種優(yōu)點，但由于是以小鼠為細(xì)胞來源，抗體的鼠源性對人具有較強(qiáng)的免疫原性，可使人體產(chǎn)生人抗鼠抗體，從而會削弱單克隆抗體的治療作用，甚至導(dǎo)致機(jī)體的免疫病理損傷。因此高親和力、高特異性、毒副作用小的全人源基因工程抗體是當(dāng)前治療性抗體研發(fā)的趨勢所在[7]。本研究成功表達(dá)純化了可溶性的金黃色葡萄球菌α-HL，以純化的α-HL作為抗原從全人源天然抗體文庫中篩選出抗α-HL的全人源單鏈抗體，為進(jìn)一步控制MRSA感染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 Ni-NTA親和純化系統(tǒng)和BenchMarkTMpre-stained protein ladder購自Invitrogen公司；輔助噬菌體M13K07、E.coli BL21、E.coli TG1及pCANTAB-5E噬菌體載體和HRP標(biāo)記的抗M13抗體、HRP標(biāo)記的抗Flag-tag抗體均購自Gene公司； rTaqDNA聚合酶和低分子量蛋白Marker購自TaKaRa公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體購自Promega公司；Discovery StudioTM購于BIOVIA。

1.2方法

1.2.1α-HL/p-Cold TF融合蛋白的表達(dá)純化 擴(kuò)增金黃色葡萄球菌α-HL基因，插入p-Cold TF載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21，測序驗證序列正確后，將陽性克隆子進(jìn)行表達(dá)。將在LBA液體培養(yǎng)基(LB含100 μg/ml 氨芐青霉素)中過夜培養(yǎng)的1 ml 菌液接種在50 ml新鮮LBA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.4～0.5，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，15℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h，離心收集細(xì)菌沉淀，0.01 mol/L PBS重懸后，超聲裂解細(xì)菌，離心收集上清，SDS-PAGE電泳鑒定后，采用Invitrogen公司的Ni-NTA親和純化系統(tǒng)對表達(dá)的可溶性α-HL融合蛋白進(jìn)行純化。

1.2.2免疫印跡法檢測抗原蛋白的表達(dá) 將純化后α-HL/p-Cold TF融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(抗His-tag抗體1∶5 000) 4℃過夜，1×PBST(1×PBS含0.05% Tween-20)洗膜3次，加二抗(HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體1∶5 000)室溫孵育1 h，1×PBST洗膜3次，加入化學(xué)發(fā)光劑(Luminata Crescendo Western HRP substrate，USA)顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.2.3抗α-HL全人源單鏈抗體的篩選 本實驗前期已成功構(gòu)建了全人源單鏈抗體(scFv)文庫，文庫容量達(dá)到2.5×108，多樣性好，可用于篩選抗α-HL單鏈抗體[8]。以生物素化的α-HL融合蛋白為抗原，采用噬菌體展示技術(shù)對全人源scFv文庫進(jìn)行4輪富集，隨機(jī)挑取富集后的文庫克隆子進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，具體方法參照文獻(xiàn)[9]。擴(kuò)增后的噬菌體抗體采用ELISA進(jìn)行檢測。α-HL純化蛋白用包被液(0.1 mol/L NaHCO3/Na2CO3溶液，pH9.6) 稀釋為20 μg/ml，于酶標(biāo)板內(nèi)4℃包被過夜。次日，于37℃用封閉液(1 × PBS 含5% 脫脂奶粉和0.05% Tween-20)封閉酶標(biāo)孔1 h，1×PBST (1×PBS 含0.05%Tween-20)洗滌后與封閉后的抗體文庫噬菌體37℃孵育1 h。洗滌酶標(biāo)孔后，加入二抗(HRP標(biāo)記的抗M13抗體)于37℃孵育1 h。最后用TMB顯色液顯色，于450 nm 處讀取吸光值(A) 。

1.2.4scFvs的可溶性表達(dá) 將scFvs和pLZ16載體[10]經(jīng)過NcoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后使用T4連接酶進(jìn)行過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，PCR及測序驗證序列正確后進(jìn)行可溶性表達(dá)。將轉(zhuǎn)化成功的菌株在LBAG液體培養(yǎng)基(LB含100 μg/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖)中培養(yǎng)至OD600=0.5，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 于32℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h，離心收集沉淀，加入0.01 mol/L PBS重懸沉淀并進(jìn)行超聲破碎，離心收集上清(為表達(dá)粗提液)備用。

1.2.5單鏈抗體的鑒定 免疫印跡法檢測抗體的表達(dá)方法同前，將表達(dá)粗提液SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉后加入HRP標(biāo)記的抗Flag-tag抗體，最后于凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。ELISA鑒定單鏈抗體性質(zhì)：包被購自Sigma的α-HL于酶標(biāo)板中用于檢測單鏈抗體與抗原的結(jié)合活性；包被金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌全菌用于檢測單鏈抗體的特異性。一抗為表達(dá)的scFvs粗提液，二抗為HRP標(biāo)記的抗Flag-tag抗體，最后加入TMB顯色液顯色，于450 nm處讀取吸光值(A) 。

2 結(jié)果

2.1α-HL融合蛋白的純化及鑒定 P-Cold TF融合表達(dá)載體攜帶有氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因，所以用Amp作為抗性篩選目的蛋白，并且P-Cold TF融合表達(dá)載體攜帶有多聚組氨酸標(biāo)簽(His-Tag)，因此利用Ni-NTA親和純化系統(tǒng)中nickel-IMAC resin對His-Tag的結(jié)合特性進(jìn)行純化。蛋白表達(dá)并純化完成后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示：成功純化出單一的目的蛋白，其大小為90 kD(圖1)，其中載體上的TF分子伴侶大小為48 kD，主要用于增加蛋白表達(dá)的可溶性。采用免疫蛋白印跡法Western blot鑒定蛋白，證明表達(dá)純化的蛋白即為目的蛋白α-HL(圖2)。

2.2抗α-HL全人源單鏈抗體的篩選 將純化的α-HL融合蛋白生物素化，并將其作為抗原，采用免疫磁珠法對天然全人源單鏈抗體文庫進(jìn)行4輪噬菌體展示富集，從富集4輪后的單鏈抗體文庫中隨機(jī)挑取克隆子，采用phage-ELISA法進(jìn)行抗原抗體結(jié)合鑒定。結(jié)果顯示:經(jīng)4輪噬菌體展示篩選后，特異性單鏈抗體得到富集。隨機(jī)挑取的1 000余個克隆子進(jìn)行ELISA初篩，取2個不包被抗原的酶標(biāo)孔作為陰性對照。結(jié)果顯示，陰性對照OD450值為0.05左右，部分克隆子與抗原有結(jié)合反應(yīng)，其中OD450>0.8的陽性單鏈抗體占34%左右，圖3為采用ELISA篩選出的部分克隆子。

圖1 SDS-PAGE電泳分析純化后的α-HL融合蛋白Fig.1 Analysis of purified α-HL fusion protein by SDS-PAGENote: Marker.Protein molecular weight marker;Lanes 1-3.Expressed protein of α-HL fusion protein.

2.3單鏈抗體的測序鑒定 將OD450值最高的18株單鏈抗體進(jìn)行大量表達(dá)后提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果表明:其中15株單鏈抗體測序序列為開放閱讀框,為linker (Ser4Gly)3連接的VH和VL。說明從天然全人源單鏈抗體文庫中成功篩選到抗α-HL全人源單鏈抗體。Discovery StudioTM展示抗α-HL全人源單鏈抗體條狀結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖2 免疫印跡法驗證α-HL融合蛋白Fig.2 Identification of α-HL fusion protein by Western blotNote: Marker.BenchMarkTM Pre-Stained Protein Ladder;Lanes 1-3.Expressed protein of α-HL fusion protein.

圖3 ELISA初篩抗α-HL全人源單鏈抗體Fig.3 Preliminary selection of scFvs against α-HL by ELISANote: 1-82.Number of different clones.The absorbance (A) reading at 450 nm was taken as the result.The negative control was about OD450=0.05.

圖4 抗α-HL全人源單鏈抗體條狀結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Ribbon diagram of anti-α-HL positive scFv(scFv777)Note: Variable regions(both VH and VL) were shown in yellow.

2.4單鏈抗體的表達(dá)鑒定 噬菌體篩選載體表達(dá)蛋白量低，所以本研究將測序成功的單鏈抗體經(jīng)雙酶切后插入前期構(gòu)建的pLZ16載體質(zhì)粒中，PCR驗證scFvs插入正確(圖5)?？贵w經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后采用免疫印跡法驗證抗體，結(jié)果顯示：抗體成功表達(dá)，目的蛋白分子量大小約為30 kD(圖6)。

2.5單鏈抗體的特異性檢測 Phage-ELISA大量篩選陽性單鏈抗體需大量抗原，所以本研究前期自行制備α-HL DNA，將其插入P-Cold TF載體再轉(zhuǎn)化入E.coli BL21經(jīng)驗證正確后進(jìn)行表達(dá)。由于P-Cold TF載體會融合表達(dá)Trigger Factor，所以為了進(jìn)一步檢測篩選出的單鏈抗體與α-HL的結(jié)合特異性，現(xiàn)將購買的α-HL(Sigma,USA)作為抗原包被酶標(biāo)板，二抗使用HRP標(biāo)記的抗Flag-tag抗體，ELISA檢測結(jié)合活性。結(jié)果顯示，篩選出的克隆子與Sigma的α-HL均具有高結(jié)合活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明篩選出的陽性抗體為針對α-HL的單鏈抗體，即為抗α-HL全人源單鏈抗體(圖7)。

圖5 PCR 驗證scFvs插入pLZ16載體結(jié)果Fig.5 Identification of amplified scFvs from pLZ16 plasmid by PCRNote: M.DNA marker DL2000 (TaKaRa,Japan);Lanes 1-15.scFv2,scFv10,scFv46,scFv214,scFv511,scFv538,scFv555,scFv718,scFv722,scFv759,scFv777,scFv802,scFv845,scFv921,scFv997.Between lane 8 and lane 9 was a negative control hole.

圖6 免疫蛋白印跡法檢測抗體表達(dá)結(jié)果Fig.6 Identification of scFvs by Western blotNote: Lanes 1-15.Expressed protein of scFv2,scFv10,scFv46,scFv214,scFv511,scFv538；scFv555,scFv718,scFv722,scFv759,scFv777,scFv802,scFv845,scFv921,scFv997.The size of protein was about 30 kD.

由于葡萄球菌是最常見的化膿性球菌，其感染主要是由金黃色葡萄球菌引起，同菌屬的白色葡萄球菌一般不致病。為檢測抗α-HL單鏈抗體的特異性，本研究將金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌全菌作為抗原包被酶標(biāo)板，抗α-HL全人源單鏈抗體為一抗，二抗為HRP標(biāo)記的抗Flag-tag抗體，ELISA結(jié)果顯示：15株抗α-HL單鏈抗體與金黃色葡萄球菌均具有高結(jié)合活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但不與白色葡萄球菌相結(jié)合，說明通過富集篩選出的抗α-HL全人源單鏈抗體具有良好的特異性(圖8)。

圖7 ELISA鑒定初篩的抗α-HL單鏈抗體Fig.7 Identification of preliminary screened scFvs against α-HL by ELISANote: The absorbance (A) reading at 450 nm was taken as the result.The negative control was about OD450=0.05.Black horizontal bars indicated standard deviation of each group.***.P<0.001.

圖8 ELISA檢測抗α-HL單鏈抗體的特異性Fig.8 Specificity of anti-α-HL scFvs detected by ELISANote: The absorbance (A) reading at 450 nm was taken as the result.The negative control was about OD450=0.05.Black horizontal bars indicated standard deviation of each group.***.P<0.001.

3 討論

金黃色葡萄球菌感染特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA的感染可造成危及生命的侵襲性感染，如肺炎、皮膚膿腫及菌血癥、心內(nèi)膜炎等。隨著全球范圍內(nèi)的抗生素濫用，出現(xiàn)了幾乎對所有抗生素耐藥的MRSA。近年來，由于抗生素研究的滯后，使得抗金黃色葡萄球菌感染的治療舉步維艱，需迫切尋求新的治療方式。已有相關(guān)資料表明，α-HL缺陷型菌株在動物感染模型中的毒力明顯下降[5]。因此，抗金黃色葡萄球菌α-HL抗體藥物的開發(fā)，作為一個全新的治療方式，具有極大臨床應(yīng)用潛能。

單克隆抗體藥物的發(fā)展經(jīng)歷了鼠源性單克隆抗體、嵌合型單克隆抗體、人源化單克隆抗體和人源性單克隆抗體的四個階段[11]。近幾年，經(jīng)美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的抗體藥物也多為人源化單克隆抗體[12,13]。采用雜交瘤技術(shù)制備的鼠源性抗α-溶血素單克隆抗體已被證實可降低感染金黃色葡萄球菌小鼠的死亡率[6]。本研究創(chuàng)新性地制備全人源單克隆抗體，其具有穿透性強(qiáng)、分子量小、便于操作，且最大程度地降低甚至消除人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)的特點，同時保留或增加了天然抗體的主要生物學(xué)活性和特異性，去除或減少無關(guān)結(jié)構(gòu)。

本研究在天然條件下純化得到α-HL融合蛋白，并通過SDS-PAGE和Western blot得以驗證。Phage-ELISA篩選出的scFvs經(jīng)測序正確后插入表達(dá)量更高的pLZ16載體中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過檢測表達(dá)的抗體蛋白與α-HL的結(jié)合活性和對金黃色葡萄球菌的特異性來鑒定單鏈抗體。實驗結(jié)果表明本研究成功篩選出了抗金黃色葡萄球菌α-HL全人源單鏈抗體。

美國基因泰克公司研究人員在Nature上發(fā)表了抗體-抗生素偶聯(lián)藥物優(yōu)于萬古霉素治療菌血癥的療效的研究結(jié)果，為治療MRSA帶來新方向[14]。后期本研究將進(jìn)一步完善抗金黃色葡萄球菌α-HL全人源單鏈抗體的生物學(xué)功能實驗，為臨床控制耐藥金黃色葡萄球菌感染提供依據(jù)。