孫兆躍，王桃妮，范瑞良，任國平，唐保軍，全為民*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)院東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實驗室,上海 200090; 2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306;3. 山東煙臺萊州市國燕育苗場,山東煙臺 261400)

近江牡蠣(Crassostreaariakensis)，又稱“赤蠔”，是在2004年從原有的種C.rivularis劃分出來的，屬于軟體動物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，異柱目(Pterioidae)，牡蠣科(Ostreidae)，是一類廣溫型和廣鹽性海洋雙殼類軟體動物[1]。據(jù)報道，近江牡蠣主要分布在山東、江蘇、上海、福建、廣東和廣西等沿海的潮間帶低潮區(qū)和淺水潮下帶[2]。

近江牡蠣是中國沿海主要的造礁牡蠣種類，例如由其作為基礎(chǔ)物種形成了山東濱州牡蠣礁、江蘇南通海門蠣岈山牡蠣礁和上海長江口牡蠣礁。近幾十年來，由于環(huán)境惡化、過度捕撈與生境破壞等原因，中國沿海牡蠣礁已嚴(yán)重退化、礁體面積急劇下降，亟待開展牡蠣礁保護(hù)與生態(tài)修復(fù)工作。其中，牡蠣苗種繁育及增殖是牡蠣礁生態(tài)修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)之一。

據(jù)統(tǒng)計，分布于中國沿海的牡蠣有20余種[2-4]，主要養(yǎng)殖品種有4種，分別為：近江牡蠣、褶牡蠣(C.plicatula)、長牡蠣(C.gigas)、大連灣牡蠣(C.talienwhanensis)[5-6]。目前，國內(nèi)已規(guī)?；绶N繁育的牡蠣種類有：長牡蠣、香港巨牡蠣(C.hongkongensis)和葡萄牙牡蠣(C.angulata)。陳璐等[7]對密鱗牡蠣(Ostreadenselamellosa)親體繁育和苗種培育技術(shù)進(jìn)行了研究，分析鹽度、溫度、密度和餌料等環(huán)境因子對密鱗牡蠣浮游幼體的生長與存活以及不同附著基對幼體附著變態(tài)的影響，首次提出了密鱗牡蠣的人工繁育技術(shù)。ROBINSON[8]通過實驗測定了熊本牡蠣(C.sikamea)性腺產(chǎn)卵的最適溫度、鹽度范圍，為熊本牡蠣產(chǎn)卵提供了文獻(xiàn)參考。于洋等[9]通過強(qiáng)化熊本牡蠣親貝營養(yǎng)和26℃以上高溫促熟培育，使熊本牡蠣親貝快速成熟，通過合理控制幼蟲密度、投喂新鮮無污染的單胞藻、及時分級篩選等系列技術(shù)措施，克服了熊本牡蠣育苗成功率低的技術(shù)難題；此外，于洋等[10]還通過“海大2號”長牡蠣與普通牡蠣做對比，在親貝培養(yǎng)與幼蟲生長發(fā)育方面作了比較實驗，得出了“海大2號”長牡蠣雖然在親貝促熟培育方面比普通牡蠣發(fā)育慢，但幼蟲期在生長速度和成活率上表現(xiàn)出較明顯的生長優(yōu)勢和較高的成活率，顯示了新品種的生長優(yōu)越性。呂曉燕[11]確立了熊本牡蠣人工繁育技術(shù)，總結(jié)了熊本牡蠣胚胎和幼蟲發(fā)育周期，并得出鹽度對幼蟲生長存活的影響要大于餌料對其生長存活影響的結(jié)論。然而，對于近江牡蠣生長發(fā)育及整個生活史過程的研究還較少。蔡英亞等[12]、梁光耀等[13]于1989年曾對于近江牡蠣(現(xiàn)鑒定該種為香港牡蠣)進(jìn)行了室內(nèi)人工授精的育苗研究，人為地將精子卵子混合形成受精卵的育苗實驗。目前國內(nèi)還沒有采用近江牡蠣精卵自然排放法進(jìn)行人工繁育研究的相關(guān)報道。

研究通過對近江牡蠣繁育的關(guān)鍵過程，例如產(chǎn)卵、受精、幼體變態(tài)發(fā)育及附著等過程進(jìn)行全面系統(tǒng)的描述，識別與掌握近江牡蠣繁育的關(guān)鍵過程及時間節(jié)點(diǎn)，從而為近江牡蠣人工繁育提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 親本采集與育肥

實驗采用的近江牡蠣親本采集于江蘇海門蠣蚜山國家級海洋公園，親本雌雄比例4∶1，個體形狀大小基本相同。平均殼長為(10.38±1.61)cm，平均殼高(13.10±2.54)cm，平均體質(zhì)量(0.38±0.18)kg。2018年4月初，將其空運(yùn)至山東省萊州市國燕育苗場進(jìn)行親貝蓄養(yǎng)，蓄養(yǎng)池體積為18 m3，池內(nèi)水溫保持在20℃～23℃，鹽度23～26。餌料主要是等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、小球藻(Chlorella)和扁藻(Platymonas)。

1.2 催產(chǎn)

近江牡蠣放置到溫度為18℃左右的暫養(yǎng)池中，通過水溫控制器調(diào)節(jié)水溫，每2 d升高0.5℃，直到溫度達(dá)到24℃，保持恒溫24℃待產(chǎn)5 d，期間每天多次投放餌料，通過溫度的不斷上升刺激牡蠣，5 d左右即可產(chǎn)卵。若仍不產(chǎn)卵，則需將牡蠣在陽光下暴露幾小時后再放入池中，即可產(chǎn)卵。

1.3 產(chǎn)卵

牡蠣經(jīng)過溫度刺激，多次投喂餌料，幾小時后牡蠣池中餌料并未被牡蠣捕食，則可靜待產(chǎn)卵。雌牡蠣卵子淡黃色，產(chǎn)卵時會將里面顆粒態(tài)的卵子噴出來；雄性牡蠣從殼里冒出一股股“白煙”，當(dāng)精卵相遇時即會受精。產(chǎn)卵結(jié)束后，24 h內(nèi)每1 h攪一次池。

1.4 培育

近江牡蠣苗種出卵24 h后，即大部分達(dá)到D形幼蟲階段，對苗種進(jìn)行選優(yōu)，挑選健康活力好，上浮的牡蠣轉(zhuǎn)移到培育池。1 d后分池培育，盡量使各池密度保持相同水平，便于投喂。用虹吸管將水池里中上層漂浮的牡蠣幼苗虹吸進(jìn)環(huán)境因素相同的全新池子中，并噴灑少量的土霉素藥育。

近江牡蠣出苗3 d左右開始投喂餌料，這個階段的牡蠣處于D形幼蟲階段，該階段一般投喂等鞭金藻餌料，每天投喂6次，每次投入0.5×104cell·mL-1的餌料，每天換水2次，換水量為養(yǎng)殖池容量的1/2。殼頂幼蟲時期餌料主要以等鞭金藻、小球藻飼喂，牡蠣大小200 μm左右。根據(jù)養(yǎng)殖池中的牡蠣苗量進(jìn)行分池，采用虹吸法和濃縮法分池，養(yǎng)殖池密度高則分池，養(yǎng)殖池密度低則合池，盡量讓養(yǎng)殖池中的牡蠣幼苗保持在相同水平，便于同時投喂。

1.5 幼蟲附著

大多數(shù)近江牡蠣苗出現(xiàn)眼點(diǎn)時，投入附著基-扇貝殼。附著基懸掛在竹擔(dān)上，水淹沒過附著基。每個竹擔(dān)上布13個掛鉤，每個掛鉤上懸掛5串貝殼串，每個貝殼串上串有100個貝殼。每天觀察扇貝殼附著情況及幼苗生長情況，3～4 d后，根據(jù)扇貝殼上的牡蠣附著情況倒串。

室內(nèi)蓄養(yǎng)池中扇貝殼上的近江牡蠣幼苗大部分附著后，將其移出室內(nèi)，轉(zhuǎn)移到室外200 m3的池子進(jìn)行中間培育，每5串貝殼串系在一個浮球上，池中水溫、鹽度與育苗池保持相同，每天投喂餌料1次，投喂量為4×105～5×105cell·mL-1。15 d后，將其移至自然水域中測定近江牡蠣稚貝的生長。

1.6 數(shù)據(jù)分析及處理

牡蠣的大小可由殼高、殼長、殼寬、體質(zhì)量4個指標(biāo)測定。殼高、殼長用游標(biāo)卡尺測量，從殼頂?shù)礁咕壍淖畲缶嚯x為殼高，貝殼前后兩端的最大距離為殼長。體質(zhì)量用電子天平稱量。

利用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，檢驗各處理間的顯著性差異，當(dāng)P﹤0.05時，認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 育苗池水溫和鹽度

圖1顯示近江牡蠣幼蟲培育期間水溫和鹽度的變化。近江牡蠣育苗池水溫大致保持在23℃上下；相反，鹽度的起伏波動變化較大，初始時達(dá)到28，而后鹽度逐步下降到20以下 ，最后穩(wěn)定在17～18左右。

2.2 近江牡蠣發(fā)育階段餌料投放數(shù)量的變化

由表1可以看出，近江牡蠣各個發(fā)育階段的投喂量也是隨幼體的不斷生長而不斷增加的，牡蠣在最初的D形幼蟲階段由于幼蟲的規(guī)格小，體積小，攝取藻類的能力也比較弱，慢慢地到了殼頂幼蟲階段，牡蠣規(guī)格不斷變大，對食物的攝取量也隨之增多，最后到變態(tài)附著階段時，牡蠣已經(jīng)長到了300 μm左右，這使得近江牡蠣幼苗攝取藻類更多，常常需要在投喂6次·d-1的過程中再增加1～2次投喂，防止投喂量太少影響其變態(tài)附著。

圖1 近江牡蠣幼蟲培育期間水溫和鹽度的變化Fig.1 Changes in water temperature and salinity during breeding larvae of Crassostrea ariakensis

2.3 幼蟲的變態(tài)發(fā)育

“D”形幼蟲：卵子受精24 h后發(fā)育至D形幼蟲，殼高約70～80 μm。剛形成的D形幼蟲沒有形成消化道，不能攝食，消化道形成后則開始攝食。

殼頂幼蟲：D形幼蟲在生長，殼頂開始慢慢鼓出，幼蟲發(fā)育到了殼頂幼蟲階段，為殼頂初期幼蟲，鉸合線稍微隆起；殼頂中期幼蟲，鉸合線明顯隆起，面盤和纖毛發(fā)達(dá)，左殼稍大于右殼；殼頂后期幼蟲，殼頂突出，左殼頂比右殼頂更為突出，左、右殼呈不對稱狀態(tài)，顯微鏡下，D形幼蟲開始出現(xiàn)纖毛，殼頂鼓出，這個時期為殼頂幼蟲時期。

眼點(diǎn)幼蟲：幼體殼長達(dá)到300 μm左右后，出現(xiàn)黑色眼點(diǎn)，標(biāo)志著牡蠣幼苗附著變態(tài)的開始。

2.4 幼蟲個體生長

表2為近江牡蠣幼蟲生長情況。前期增長較快，殼高以每天10 μm的速度在增長，之后近江牡蠣進(jìn)入緩慢增長階段。

2.5 稚貝個體生長

近江牡蠣稚貝的生長情況見圖3。1.5月齡的稚貝殼高為3～5 mm，平均殼高(3.0±0.2)mm；2.5月齡平均殼高增長至(6.1±0.3)mm；5.5月齡平均殼高增長至(11.2±0.5)mm；6.5月齡平均殼高增長至(14.8±0.5)mm。

表1 近江牡蠣餌料投放數(shù)量的變化Tab.1 Quantities of feeding diet during larval stages of Crassostrea ariakensis

表2 近江牡蠣幼蟲變態(tài)發(fā)育期間殼長和殼高的變化Tab.2 Change in Shell width and height of Crassostrea ariakensis larvae

圖2 近江牡蠣幼蟲不同發(fā)育階段的形態(tài)Fig.2 Morphology of Several length stages of Crassostrea ariakensi注：上左：二細(xì)胞；上中：四細(xì)胞；上右：桑葚胚；下左：D形幼蟲；下中：殼頂幼蟲；下右：眼點(diǎn)幼蟲Note：upper left: two cell; upper middle: four-cell; upper right: morula; bottom left: D-shaped larvae; bottom middle: umbo larvae; bottom right: eyebot larvae

圖3 近江牡蠣稚貝的生長Fig.3 Change in shell height of Crassostrea ariakensis spat

3 討論

近江牡蠣一直被認(rèn)為是河口低鹽性種類。謝忠明[14]、薛凌展等[15]認(rèn)為近江牡蠣對低鹽度有較強(qiáng)的抗性，但對高鹽度的耐受性弱，適宜棲息在河口咸淡水環(huán)境。姚托等[16]通過鹽度對近江牡蠣影響的實驗研究中得出，近江牡蠣的生存鹽度范圍為10～30，最適生存鹽度為 10～25。本實驗中，近江牡蠣人工繁育的育苗池鹽度與親本采集地點(diǎn)的鹽度基本一致(鹽度25～28)，實驗結(jié)果表明，在高鹽度條件下，近江牡蠣仍然能夠完成繁育過程。這正好印證了姚托等[16]的觀點(diǎn)。近江牡蠣被認(rèn)為是河口低鹽性種類，而它也可以在高鹽條件下生長存活，說明近江牡蠣具有一定的高鹽耐受性潛力，能在面對高鹽脅迫時通過自身調(diào)節(jié)滲透壓使自身維持鹽度平衡，維持整個生命過程。

溫度也是制約牡蠣幼蟲生長和存活的重要因素。隋錫林等[17]在太平洋牡蠣的人工育苗過程中認(rèn)為，溫度高于26℃可能影響到幼蟲的代謝，致使幼蟲活力降低,易下沉,培育幼蟲較為困難。徐成勛等[18]在實驗水溫35℃時觀察到殼金長牡蠣幼蟲生長最快，但伴隨著較高的死亡率。在本實驗中，溫度在26℃以上時，確實是存在幼苗下沉，活力降低的現(xiàn)象，這與隋錫林等[17]和王丹麗等[19]研究結(jié)果相似，當(dāng)遇到這個問題時，本實驗調(diào)整育苗池溫度到23℃，牡蠣幼體的死亡率下降，活力也明顯提高。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能有兩方面：一方面，高溫提高了幼蟲的攝食速率[20]，并且提高了體內(nèi)消化酶的活性，促進(jìn)幼蟲對攝食餌料的異化作用，從而加快了幼蟲的生長；另一方面，高溫會加快水中原生動物等敵害生物的繁殖，增加耗氧，并且使貝類體內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量減少，溶菌酶的活性下降，從而造成幼蟲短時間內(nèi)的大量死亡[21]。因而保持適宜的溫度是保證實驗成功的前提，本實驗中溫度一直保持在23℃上下，通過水溫控制器來調(diào)節(jié)溫度變化，實現(xiàn)育苗池溫度的基本恒定。實驗中近江牡蠣從受精卵至眼點(diǎn)幼蟲期約經(jīng)歷35 d，比一般認(rèn)為的14～20 d浮游幼體生活史階段更長一些，可能與育苗池水溫低有關(guān)。

近江牡蠣育苗過程中，D形幼蟲長到150 μm左右時，出現(xiàn)停止生長或者增長緩慢，這個時期近江牡蠣最容易沉降死亡。本實驗一共培育3批苗，前兩批苗均是到150 μm左右就停止生長，1周后就沉降死亡，這段時期正是由D形幼蟲變態(tài)至殼頂幼蟲期階段，是牡蠣幼體變態(tài)發(fā)育的關(guān)鍵時期，養(yǎng)殖條件不適宜，牡蠣幼體就無法突破殼頂長成殼頂幼蟲，因此這個時期是牡蠣生長發(fā)育過程中最關(guān)鍵的時期。

然后，導(dǎo)致殼頂幼蟲不能突破的原因目前還不確定，初步認(rèn)為造成牡蠣幼體難以突破殼頂長成殼頂幼蟲的原因有兩個方面，一是，牡蠣養(yǎng)殖實驗期間正處于5—6月，此時山東萊州的氣溫較高，育苗室較悶熱，牡蠣幼苗活力減弱，投放餌料時牡蠣攝入不足，遺留的餌料使池內(nèi)病菌增生，增加耗氧，使牡蠣幼體缺氧導(dǎo)致死亡；二是，5—6月渤海灣地區(qū)的連續(xù)高溫降雨，灣內(nèi)的水生生物大量繁殖，造成水體污染，灣內(nèi)水循環(huán)不通暢，導(dǎo)致養(yǎng)殖用水被污染，牡蠣幼體可能受水體污染的影響而下沉導(dǎo)致沉降死亡。由于人力及經(jīng)費(fèi)成本的制約，本實驗研究僅完成了近江牡蠣人工繁育的初步試驗，成功培育出近江牡蠣稚貝。未來，需對近江牡蠣繁育的水溫、鹽度、餌料等條件進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以便形成標(biāo)準(zhǔn)化的人工繁育技術(shù)。