李 倩，李悝悝，張付云*

（1.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所 天然產(chǎn)物與糖工程研究組大連市糖類農(nóng)用制劑工程研究中心，遼寧 大連 116023）

褐藻膠又稱藻酸、海藻酸鈉，是一些大型藻類的細(xì)胞壁、細(xì)胞間質(zhì)的主要組成成分[1]。褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronate，G）兩種糖醛酸殘基通過β-1,4糖苷鍵相互連接而成的線性高分子聚合物[2]。依據(jù)海藻種類、藻體組織部位、生態(tài)環(huán)境、季節(jié)等的不同，M和G單體的含量比也具有差異[3]。褐藻膠及其衍生物的獨(dú)特理化性質(zhì)，如良好的凝膠特性和穩(wěn)定性，使其被廣泛應(yīng)用于食品、紡織和化工等領(lǐng)域[4]。但天然褐藻膠為分子質(zhì)量較大的高聚物，黏度高、難溶于水，限制了褐藻膠的應(yīng)用。褐藻膠寡糖作為一種功能性寡糖，不僅解決了天然褐藻膠應(yīng)用上的瓶頸問題，且其具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)[5]、抗凝血、抗高血脂[6]、抗氧化[7-9]等，也可以作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，應(yīng)用于綠色農(nóng)業(yè)[10-11]。因此，如何有效獲得褐藻膠的降解產(chǎn)物——褐藻寡糖勢(shì)在必行。

目前，褐藻寡糖的制備方法有物理法、化學(xué)法和生物酶法[2]。常用的物理法包括輻射、熱降解和超聲等，但此類方法不能將天然褐藻膠完全降解，且操作繁瑣、價(jià)格昂貴，容易造成資源浪費(fèi)。化學(xué)法以酸降解為主，但該方法降解條件難以控制，耗時(shí)長(zhǎng)且產(chǎn)物品質(zhì)較差，可能對(duì)褐藻膠還原端造成一定程度的破壞，進(jìn)而影響降解產(chǎn)物即褐藻寡糖的生物活性；同時(shí)大量化學(xué)試劑的應(yīng)用造成環(huán)境污染。生物酶法是采用褐藻膠降解酶通過β-消去反應(yīng)斷裂褐藻膠的糖苷鍵，產(chǎn)生的新還原端為飽和糖醛酸鹽，該方法專一性強(qiáng)、效率高、反應(yīng)溫和、可控性強(qiáng)，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，且能為后續(xù)研究寡糖活性化學(xué)結(jié)構(gòu)提供信息，并滿足不同用途的需要[12]，故酶法降解逐步成為優(yōu)先選擇的方法。

褐藻膠降解酶來源廣泛[13]，在細(xì)菌、真菌中均有發(fā)現(xiàn)[14]，其中，海洋來源的微生物是褐藻膠裂解酶的重要來源。由于現(xiàn)階段報(bào)道的微生物來源的褐藻膠降解酶中，仍然存在酶活力低、作用位點(diǎn)單一等缺點(diǎn)[15-16]。因此，篩選能夠降解褐藻膠的新菌株，對(duì)發(fā)掘具有潛在產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的褐藻膠裂解酶具有重要意義。本研究從大連長(zhǎng)興島采集的腐爛海帶樣品中，篩選能夠降解褐藻膠的菌株，并通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，豐富褐藻膠降解酶新菌種資源，為褐藻膠降解的深入研究及酶法制備褐藻膠寡糖產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

腐爛海帶：采自遼寧省大連市長(zhǎng)興島海域。

1.1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽溶液：NaCl 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g/L，去離子水配制。

分離培養(yǎng)基：在1 L無機(jī)鹽溶液中加入褐藻酸鈉7 g，（NH4）SO45 g，瓊脂20 g。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：在1 L無機(jī)鹽溶液中加入褐藻酸鈉10 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g。

以上培養(yǎng)基均在121℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

細(xì)菌基因組抽提試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BM5000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：北京博邁德科技發(fā)展有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）所用試劑：寶生物工程（大連）有限公司；褐藻膠（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HBI細(xì)菌生理生化鑒定條：青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色試劑盒：北京索萊寶生物科技有限公司；其他所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ML104/02電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；YXQ-LS-50sII立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；MS-S磁力攪拌器：大連元博科學(xué)器材有限公司；QHZ-98A全溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；Hybaid型PCR儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CR-22E高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；Multiskan Ascent酶標(biāo)儀：芬蘭Labsystems公司；IX73型顯微鏡、FV1000MPE雙光子共聚焦顯微鏡：日本Olympus公司；GelDoc-It型凝膠成像儀：美國(guó)UVP公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離純化

稱取樣品10g于裝有90 mL無菌水及轉(zhuǎn)子的三角瓶中，于磁力攪拌器上600 r/min條件下攪拌10 min，待樣品充分分散后，靜置10 min，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，取上清液制備10倍系列稀釋樣品勻液，稀釋度為10-1～10-9。分別取各梯度稀釋液0.2 mL涂布于以褐藻酸鈉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基平板，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～4 d，挑取顏色及菌落形態(tài)不一的菌株進(jìn)行多次劃線，分離純化。

1.3.2 產(chǎn)褐藻膠降解酶菌株的篩選

挑取單菌落分別接種于裝有7.5 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的50 mL離心管中，于37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12 h，作為種子液備用。以2%（V/V）的接種量將種子液接種于裝有50 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，于37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定褐藻膠降解酶活力，篩選褐藻膠降解酶活力高的菌株。

1.3.3 褐藻膠降解酶活力測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[17]測(cè)定褐藻膠降解酶活力。以O(shè)D540nm值（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（x）為橫縱標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.194x-0.026 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，線性關(guān)系良好，可用于褐藻膠降解酶活力的測(cè)定。

發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液。取500 μL粗酶液與500 μL 0.3%褐藻膠于37℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，然后于沸水浴中加熱10 min終止反應(yīng)，12 000 r/min離心2 min，取400 μL上清液加入300 μL DNS試劑，沸水浴加熱10 min后立即冷卻，加無菌水定容至1.5 mL，取200 μL于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值。以沸水浴10 min高溫進(jìn)行滅活的酶作為對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)平行。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出還原糖含量，從而計(jì)算出酶活力大小。

酶活力單位定義：每分鐘催化褐藻膠產(chǎn)生1 μmol還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/L）。

1.3.4 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將篩選菌株劃線于分離培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)24 h，肉眼觀察單菌落形態(tài)。然后挑取單菌落于油鏡下觀察其顯微形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

生理生化試驗(yàn)：采用HBI細(xì)菌生理生化鑒定條對(duì)菌株的生理生化特征進(jìn)行測(cè)定，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

分子生物學(xué)鑒定：利用細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，利用16S rDNA通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[18]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR 緩沖液10 μL，基因組1.5 μL，10 μmoL/L通用引物各4 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixture8μL，r Taq酶1μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至100 μL，混勻。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，切膠回收，送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與EZBioCloud數(shù)據(jù)庫中模式菌株的核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取親緣關(guān)系相近的模式菌株，通過MEGA5.0軟件[19]中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)褐藻膠降解酶菌株的篩選

以褐藻膠為唯一碳源，共篩選到8株能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)的菌株，編號(hào)為E6-1、E6-2、E5、E8、F3、F1、E10、F4。將其分別轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，采用DNS法對(duì)菌株降解褐藻膠的能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 不同菌株降解褐藻膠能力的比較Fig.1 Comparison of alginate degradation ability between different strains

由圖1可知，篩選得到的8株菌株均具有降解褐藻膠的能力。其中，菌株E-10所產(chǎn)褐藻膠降解酶活力最高，為14U/L，其褐藻膠降解酶活力顯著高于菌株E6-1（6 U/L）、F1（9 U/L）和菌株F3（6 U/L）（P＜0.05）；其次為菌株E5（11 U/L）；菌株F3的褐藻膠降解酶活力最低，為6 U/L。LANGE B等[20]研究表明，克雷伯氏菌來源的褐藻膠降解酶作用底物為多聚葡萄糖醛酸組成的褐藻膠，特異性斷裂G-G之間的糖苷鍵，本文中所使用的底物為G和M交替連接組成的褐藻膠，故此可能為E6-1和F3酶活力較低的原因?，F(xiàn)在，通過基因重組或酶的定向進(jìn)化技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的改造和酶活力的提升[21-22]，本研究所篩選獲得的菌株E-10雖活性較低，但是作為一種新的產(chǎn)酶菌株，可通過上述生物技術(shù)對(duì)其進(jìn)一步研究以拓寬褐藻膠降解酶酶源。因此，篩選菌株E-10進(jìn)行深入研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株E-10在分離培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖2A、細(xì)胞形態(tài)見圖2B，細(xì)胞經(jīng)革蘭氏染色后的細(xì)胞形態(tài)見圖2C。

圖2 菌株E-10的菌落（A）和細(xì)胞（B和C）形態(tài)Fig.2 Colonial(A)and cell(B and C)morphology of strain E-10

由圖2A可知，菌株E-10的菌落呈圓形，邊緣整齊，初始生長(zhǎng)表面光滑透明、濕潤(rùn)，后期菌落表面呈乳白色半透明，且有干粉狀物質(zhì)位于菌落表面；由圖2B可知，菌株E-10的細(xì)胞為短小棒狀；由圖2C可知，菌株E-10經(jīng)革蘭氏染色后為紫色，說明菌株E-10為革蘭氏陽性菌。

2.2.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)《細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[23]，對(duì)菌株E-10的生理生化特征進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 菌株E-10的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain E-10

由表1可知，明膠試驗(yàn)呈陽性，說明菌株E-10具有運(yùn)動(dòng)性；菌株E-10產(chǎn)鳥氨酸脫羧酶；能利用D-甘露醇、水楊苷、木糖、麥芽糖以及七葉苷；不產(chǎn)苯丙氨酸酶、尿素酶和脂酶；西蒙氏枸櫞酸鹽、吲哚試驗(yàn)呈陰性。結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，初步判定菌株E-10為萊茵海默氏菌屬（Rheinheimera）。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株E-10的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株E-10 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis result of 16S rDNA PCR amplification product of strain E-10

由圖3可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度約為1 500 bp，與目的基因的堿基長(zhǎng)度一致，且條帶較為完整，說明PCR擴(kuò)增成功。

菌株E-10 16S rDNA序列與EZBioCloud數(shù)據(jù)庫中模式菌株的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株E-10的16S rDNA基因序列與萊茵海默氏菌屬（Rheinheimera）的相似度較高，與水萊茵海默氏菌（Rheinheimeraaquimaris）SW-353（EF076757）、日本粳稻萊茵海默氏菌（Rheinheimerajaponica）KMM 9513（LC004727）、太平洋萊茵海默氏菌（Rheinheimerapacifica）KMM1406（AB073132）、明岑貝格萊茵海默氏菌（Rheinheimera muenzenbergensis）E49（JQ922424）的相似度分別為99.93%、98.51%、98.50%、98.43%。為了進(jìn)一步確定菌株E-10的分類地位，選取相似度較高的模式菌株，采用MEGA 5.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4 基于16S rDNA序列菌株E-10的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain E-10 based on 16S rDNA sequences

由圖4可知，菌株E-10與水萊茵海默氏菌（Rheinheimera aquimaris）（EF076757）聚于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此，將菌株E-10鑒定為一株水萊茵海默氏菌（Rheinheimera aquimaris）。

3 結(jié)論

本研究以褐藻膠為唯一碳源，從長(zhǎng)興島采集的腐爛海帶中篩選得到能夠高效降解褐藻膠的菌株E-10，褐藻膠降解酶活力為14 U/L。通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定菌株E-10為水萊茵海默氏菌（Rheinheimera aquimaris）。首次報(bào)道了萊茵海默氏菌具有降解褐藻膠的能力，此菌株的篩選和鑒定豐富了褐藻膠降解酶新微生物酶源，對(duì)發(fā)掘具有潛在產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的褐藻膠降解酶具有重要意義。