病死雞尸體發(fā)酵堆肥中蛋白酶分解菌的分離鑒定及發(fā)酵工藝的研究

郭芳先 肖發(fā)沂 馮傳明 陳永科 劉鎮(zhèn)

摘? 要：從雞場(chǎng)病死雞自然發(fā)酵堆肥中取樣，分離篩選得到一株產(chǎn)蛋白酶活性高（揺瓶培養(yǎng)基酶活為2000U/ml）的菌株，經(jīng)過鑒定，該菌株為解淀粉芽孢桿菌。本文通過不斷優(yōu)化該菌株的產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝，最終確定了該菌在100～2000L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝，放罐芽孢數(shù)可達(dá)3.1×1010CFU/ml，芽孢率≥98%。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;分離鑒定;發(fā)酵

中圖分類號(hào)：S858.314.4+3? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2019）02-0024-03

病死動(dòng)物尸體堆肥發(fā)酵因其簡(jiǎn)單實(shí)用、經(jīng)濟(jì)環(huán)保并能產(chǎn)生穩(wěn)定高效植物肥料的特點(diǎn)，已成為病死動(dòng)物尸體無害化處理的主流方式，也是符合我國養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀的合理有效的處理方式之一[1]。但是傳統(tǒng)的堆肥法主要依靠自然界的微生物進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程受環(huán)境溫度、原材料等因素的影響，發(fā)酵效率太低，且占地面積較大。本研究主要是從傳統(tǒng)病死雞尸體發(fā)酵堆肥中篩選分解蛋白酶的優(yōu)勢(shì)微生物，并研究這些微生物的發(fā)酵工藝，將其制備成菌劑，提高病死雞尸體發(fā)酵堆肥的效率。

1? 材料與方法

1.1? 樣品? 采用四點(diǎn)取樣法取濰坊市某養(yǎng)雞場(chǎng)病死雞尸體自然發(fā)酵的好氧堆肥升溫期的樣品。

1.2? 培養(yǎng)基

1.2.1? 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000ml，pH7.0。

1.2.2? 高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，氯化鈉0.5g，硝酸鉀1g，三水磷酸氫二鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，七水硫酸亞鐵0.01g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000ml，pH7.5。

1.2.3? 真菌培養(yǎng)基采用含有氯霉素的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA），青島海博生產(chǎn)。

1.2.4? 蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀0.36g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鋅0.014g/L，磷酸氫二鈉1.07g/L，氯化鈉0.16g/L，氯化鈣0.002g/L，硫酸亞鐵0.002g/L，干酪素4g/L，胰酪胨0.05g/L，瓊脂粉20g/L，pH6.8～7.0。

1.3? 試驗(yàn)材料? 包括豆粕、玉米粉、玉米淀粉、葡萄糖、玉米漿、氯化銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉等。

1.4? 試驗(yàn)設(shè)備? 有干燥箱、滅菌鍋、搖床、培養(yǎng)箱、50L全自動(dòng)發(fā)酵罐、100～2000L發(fā)酵罐等。

1.5? 試驗(yàn)方法

1.5.1? 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及分離鑒定? 稱取10g樣品與滅菌的裝有90ml生理鹽水的錐形瓶中，在搖床上充分震蕩30min，采用稀釋涂布平板法將10-4、10-5、10-6三個(gè)梯度各100μl分別涂布于NA、高氏1號(hào)培養(yǎng)基和PDA平板中。每個(gè)梯度做4個(gè)重復(fù)，NA平板放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d，高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板和PDA平板放在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4d。然后挑選不同形態(tài)的菌落分別接種至蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)菌菌落放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d，放線菌和真菌菌落放在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4d，觀察透明圈。將有透明圈的菌落進(jìn)一步分離純化，然后進(jìn)行保存，并將斜面菌種送至鑒定機(jī)構(gòu)進(jìn)行菌種鑒定。

1.5.2? 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的研究

1.5.2.1? 搖瓶配方試驗(yàn)? 選擇各種發(fā)酵常用物料，進(jìn)行搖瓶配方的摸索，通過多次正交試驗(yàn)，初步確定發(fā)酵配方。

1.5.2.2? 2000L發(fā)酵罐配方試驗(yàn)? 在搖瓶配方初步確定的基礎(chǔ)上進(jìn)行50L發(fā)酵罐小試，然后用100～2000L發(fā)酵罐進(jìn)行中試，最終確定該菌的發(fā)酵配方。

1.5.2.3? 100～2000L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的研究? 對(duì)發(fā)酵罐的通風(fēng)量和轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整，以促進(jìn)菌種的快速繁殖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及分離鑒定

2.1.1? 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選? 經(jīng)過多輪篩選，最后只有1#菌株在蛋白酶篩選培養(yǎng)基平板上有透明圈，將1#菌株接種至蛋白酶揺瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測(cè)發(fā)酵液酶活，平均酶活為2000U/ml，1#菌株在NA平板和蛋白酶篩選平板上的菌落形態(tài)見圖1所示。

2.1.2? 1#菌株分離鑒定結(jié)果? 經(jīng)過鑒定機(jī)構(gòu)的鑒定，1#菌株為解淀粉芽孢桿菌。

2.2? 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的研究

2.2.1? 揺瓶配方試驗(yàn)? 通過多次揺瓶實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)揺瓶菌數(shù)及芽孢率，最后確定該菌種的揺瓶發(fā)酵配方碳源為玉米淀粉、葡萄糖，氮源為豆粕、氯化銨，無機(jī)鹽為硫酸鎂、硫酸錳等。

2.2.2? 2000L發(fā)酵罐配方試驗(yàn)? 上述揺瓶配方適當(dāng)增加濃度分別進(jìn)行50L罐小試，100～2000L發(fā)酵罐中試，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（取平均值）如表1。

從表1數(shù)據(jù)可以看出，50L的發(fā)酵配方為搖瓶配方中各組分均增加0.5倍，2000L發(fā)酵罐的發(fā)酵配方為揺瓶配方中的各組分均增加1倍，放罐芽孢數(shù)最高。適當(dāng)增加揺瓶配方中各組分的濃度有利于提高發(fā)酵的放罐芽孢數(shù)，這是因?yàn)?000L發(fā)酵罐的溶解氧比50L發(fā)酵罐和三角瓶中的溶解氧效果都好。但是如果配方濃度太大，造成培養(yǎng)基中缺氧，反而容易引起菌體的死亡，不易形成芽孢，影響最終的芽孢數(shù)量。

2.2.3? 100～2000L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的研究? 在菌種發(fā)酵過程中，通過提高發(fā)酵罐中的通風(fēng)量和提高轉(zhuǎn)速，有利于為菌種提供更多的溶解氧，從而促進(jìn)菌種的快速繁殖，縮短發(fā)酵時(shí)間，節(jié)約發(fā)酵成本。表2和表3分別是調(diào)整發(fā)酵罐的通風(fēng)量和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵時(shí)間和放罐芽孢數(shù)的影響。

從表2、表3中可以看出，有效的調(diào)整通風(fēng)量和發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速，可以明顯縮短菌種的發(fā)酵時(shí)間，但是對(duì)放罐芽孢數(shù)基本沒有影響。

3? 結(jié)論與分析

該研究從濰坊某養(yǎng)雞場(chǎng)尸體堆肥中分離出了一株產(chǎn)蛋白酶酶活較高的解淀粉芽孢桿菌，經(jīng)揺瓶實(shí)驗(yàn)，蛋白酶酶活可達(dá)2000U/ml。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)蛋白酶[2，3]，但是大部分都分離自土壤，主要用來做飼料添加劑，用于做尸體發(fā)酵方面的報(bào)道很少。

芽孢是細(xì)菌休眠體，產(chǎn)芽孢細(xì)菌在營養(yǎng)條件缺乏時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)形成圓形或橢圓形的芽孢休眠體。芽孢含水量極低，抗逆性強(qiáng)，能經(jīng)受高溫、紫外線、電離輻射以及多種化學(xué)物質(zhì)滅殺等，條件適宜時(shí)，芽孢會(huì)重新成為一個(gè)細(xì)菌[4];由于芽孢較其營養(yǎng)體細(xì)胞易保藏、復(fù)活率高，是制備菌粉制劑的理想存在形式，所以本研究通過多次反復(fù)試驗(yàn)確定了解淀粉芽孢桿菌的2000L發(fā)酵罐的產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基，并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，縮短了該菌的發(fā)酵時(shí)間（由原來的25h縮短為20h），降低了發(fā)酵成本，為以后制備病死雞堆肥發(fā)酵菌劑提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 續(xù)彥龍，王麗麗，龔改林，等.堆肥法無害化處理染疫動(dòng)物尸體的研究進(jìn)展[J].畜牧與獸醫(yī)，2015，47（4）：138-140.

[2]? 謝為天，李紅勝，劉穎，等.一株源于紅樹林土壤芽孢桿菌的鑒定及其蛋白酶學(xué)性質(zhì)研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（9）：155-158.

[3]? 付文娟，楊亞晉，王慶，等.高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及其提高發(fā)酵豆粕肽含量效果研究[J].中國畜牧雜志，2013，49（23）：41-46.

[4]? Higgins D，Dworkin J.Recent progress in Bacillus subtilis sporulation[J].Fems Microbiology Reviews，2012，36（1）：131-148.