呂行直，李瑞芳，高子涵，王紅偉，李三強，王建剛

（河南科技大學1.醫(yī)學院藥理學與分子生物學重點實驗室，2.護理學院，河南洛陽 471023）

肝損傷是肝硬變、重型肝炎和原發(fā)性肝癌的起始要素，因此尋找新型治療藥物是目前臨床防治肝病的重要環(huán)節(jié)[1]。針對發(fā)病機制，探究肝病的病因?qū)W與病理過程中特異性的分子靶點，是研究護肝保肝新藥的方向之一。近期研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化和急性肝損傷都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）密切相關(guān)[2]。已有研究報道，四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）經(jīng)由ERS 導致肝損傷，其機制大多與通過激活線粒體凋亡通路誘導肝細胞凋亡有關(guān)。但是，CCl4進入體內(nèi)后，經(jīng)細胞色素P450酶代謝激活，產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的磷脂分子發(fā)生共價結(jié)合，引起脂質(zhì)過氧化，從而誘發(fā)ERS，影響蛋白質(zhì)的合成與修飾，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，關(guān)于CCl4通過影響氧自由基的生成引起ERS的研究報道還相對較少。

柴胡（B. chinense DC）是一種傳統(tǒng)中藥，主要用于治療感冒發(fā)熱和肝氣郁滯等病癥。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷（saikosaponin，SS）可阻止肝炎向肝硬變的轉(zhuǎn)變，并且對脂多糖、D-氨基半乳糖和卡介苗誘導的急慢性肝損傷均有顯著的修復及保護作用[3]。SS-b2是SSb的主要藥理活性成分之一，但是關(guān)于其護肝作用及其與ERS相關(guān)機制的研究還未見報道。本研究通過研究SS-b2 對CCl4誘導的急性肝損傷的保護作用及其對ERS 蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）通路的調(diào)控作用，闡明SS-b2 的對肝損傷保護作用的分子機制，為臨床上SS-b2制劑治療肝疾病提供理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性BALB/c 小鼠60 只，清潔級，體質(zhì)量23～25 g，湖北省華中科技大學醫(yī)學院動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2010-0007。小鼠在通風良好、溫度20～25℃、濕度50%～60%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2 藥品、試劑和主要儀器

SS-b2（成都瑞芬思生物科技有限公司，純度＞99%，批號：C-051-150728）；水飛薊素（silymarin，成都曼斯特生物科技有限公司，純度＞98%，批號：A-0131）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT，貨號：20170513）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamicoxaloacetic transaminase，GOT，貨號：20170522）、丙二醛（malondialdehyde，MDA，貨號：20170306）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，貨號：20170424）試劑盒均購自南京建成科技有限公司；一抗：兔抗小鼠PERK、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、轉(zhuǎn)錄激活因 子4（activating transcrip-tion factor 4，ATF4）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancerbindingprotein homologous protein，CHOP）和β 肌動蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；兔抗小鼠磷酸化真核起始因子2α（phospho-eukaryotic initiation factory 2α，p-eIF2α）單克隆抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；SP 通用免疫組化試劑盒（貨號：SP-9000）購于中杉金橋公司；其他化學試劑均為分析純。

全波長酶標儀（美國BioTek有限公司）；垂直板蛋白電泳儀和電轉(zhuǎn)儀（美國BioRad公司）；RM2235切片機（德國Leica 公司）；冰凍臺式高速離心機（美國KENDRO 公司）；Western blot 成像系統(tǒng)（美國Azure公司）。

1.3 小鼠急性肝損傷模型建立[4]

60只雄性BALB/c小鼠隨機分為6組，每組10只，即正常對照組、模型組、SS-b2（5，10和20 mg·kg-1）組、水飛薊賓（陽性藥物，10 mg·kg-1）組，各組連續(xù)7 d 每天1次ip給予不同藥物或等量生理鹽水（正常對照組和模型組）；于末次給藥2 h后，除正常對照組外，其余各組均一次性ip給予5%CCl4（以橄欖油配制）誘導小鼠急性肝損傷模型。造模后連續(xù)6 h 禁食不禁水。電子天平稱量小鼠體質(zhì)量，而后眼眶取血；處死小鼠，將小鼠肝完全剪下并稱量肝質(zhì)量，計算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。部分肝組織固定于4%多聚甲醛中，其余凍存于-80℃超低溫冰箱中用于檢測信號通路蛋白。

1.4 微板法檢測小鼠血清中GPT，GOT 和SOD 活性及MDA含量

實驗結(jié)束時，取小鼠眼眶血，4℃，2000×g 離心，取上清；參照試劑盒說明書檢測血清中GPT，GOT和SOD的活性和MDA的含量。

1.5 HE染色檢測肝組織病理變化[5]

取肝組織相同部位固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片機切至4 μm的切片，常規(guī)HE染色后，光學顯微鏡下觀察、拍照記錄。

1.6 免疫組織化學法檢測肝組織PERK蛋白水平[4]

取肝組織石蠟切片，進行免疫組織化學染色[3]，按照SP通用免疫組化試劑盒說明書的步驟進行操作，PERK 抗體（1∶200）4℃孵育過夜。中性樹膠封片后，顯微鏡拍照、觀察記錄。采用圖像分析軟件Image-pro Plus進行免疫組化結(jié)果的半定量分析。

1.7 Western蛋白印跡法檢測小鼠肝組織中PERK，GRP78，p-elF2α，ATF4和CHOP蛋白水平[6]

取肝組織，裂解液裂解后4℃下7000×g 離心10 min，取上清，BCA試劑盒蛋白定量。取80 μg蛋白，加入上樣緩沖液煮沸變性，10% SDS-PAGE 電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗PERK（1∶500），GRP78（1∶1000），p-eIF2α（1∶500），ATF4（1∶500），CHOP（1∶200）和β 肌動蛋白（1∶5000）4℃孵育過夜，再加二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，用凝膠定量分析軟件Gel-Pro analyzer4.0對蛋白條帶吸光度值進行半定量分析。以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 SS-b2 對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠肝指數(shù)的影響

模型組小鼠肝指數(shù)較正常對照組顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，SS-b2 10和20 mg·kg-1組小鼠肝指數(shù)顯著降低（P<0.05），而SS-b2 5 mg·kg-1組和水飛薊素組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

Tab.1 Effect of saikosaponin-b2（SS-b2）on liver mass and liver index of CCl4-induced acute liver injury mice

2.2 SS-b2 對CCl4致急性肝損傷小鼠肝功能和氧化應激的影響

與模型組比較，SS-b2 5，10和20 mg·kg-1和水飛薊素顯著降低急性肝損傷小鼠血清GOT和GPT的活性（P<0.05，P<0.01），增強血清SOD 的活性（P<0.05），并降低MDA 的含量（P<0.05，P<0.01），提示SS-b2 可顯著改善急性肝損傷模型小鼠的肝功能和氧化應激反應（表2）。

2.3 SS-b2 對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖1 所示，正常對照組小鼠肝組織中肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊；模型組肝細胞腫脹嚴重，肝小葉周圍胞核溶解，呈大片紅染區(qū)，炎癥細胞浸潤，肝索排列紊亂。SS-b2 5，10 和20 mg·kg-1組和水飛薊素組肝小葉周圍紅染區(qū)域明顯減少，胞核溶解區(qū)域減少，肝細胞腫脹程度減輕，細胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。表明SS-b2能顯著改善小鼠急性肝損傷。

Fig.1 Effect of SS-b2 on liver histopathological changes in CCl4-induced acute liver injury mice by HE staining.See Tab.1 for the mouse treatment. The arrows show nuclear dissolution area.

2.4 SS-b2對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織PERK蛋白表達水平的影響

如圖2 所示，正常對照組小鼠肝細胞結(jié)構(gòu)正常，肝索排列完整，僅在中央靜脈周圍有少量PERK 蛋白表達，且主要表達于胞漿；模型組小鼠肝中央靜脈周圍PERK 蛋白陽性表達較正常對照組顯著增加（P<0.01），細胞排列紊亂；與模型組比較，SS-b2 5，10 和20 mg·kg-1組PERK 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），且隨著劑量的增加PERK 表達量下降，同時肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善；陽性藥水飛薊賓組PERK 蛋白的表達水平也明顯降低（P<0.05）。

Tab.2 Effect of SS-b2 on GPT，GOT and SOD activitities and MDA content in serum of CCl4-induced acute liver injury mice

Fig.2 Effect of SS-b2 on expression of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase（PERK）in CCl4-induced acute liver injury mice observed by immunohistochemistry. See Tab.1 for the mouse treatment. B was the semi-quantitative result of A. IA：integrated absorbance. x±s，n=10. ＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with model group.

2.5 SS-b2 對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響

如圖3所示，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中PERK，p-eIF2α，ATF4，GRP78和CHOP蛋白表達水平顯著增高（P<0.01）；與模型組相比，SS-b2 10和20 mg·kg-1組小鼠肝組織ERS通路相關(guān)蛋白PERK，p-eIF2α，ATF4，GRP78和CHOP的表達顯著降低（P<0.01），而SS-b2 5 mg·kg-1組可顯著降低PERK 通路其他蛋白的表達，但對GRP78蛋白表達無明顯影響。水飛薊賓組也能顯著降低上述ERS 通路蛋白的表達（P<0.01）。提示SS-b2能抑制急性肝損傷時ERS通路的激活。

Fig.3 Effect of SS-b2 on protein expressions involved in endoplasmic reticulum stress signal pathway in liver of CCl4-induced acute liver injury mice detected by Western blotting. See Tab.1 for the mouse treatment. B was the semi-quantitative result of A. x±s，n=10. ＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with model group.

3 討論

近年來，肝病的發(fā)病率逐年攀升，如肝炎、肝硬變及肝癌等，嚴重危害人類的健康。柴胡的主要成分SS 對肝纖維化、腫瘤和腎病等疾病有明顯的療效，其中以保肝護肝作用最為顯著，這與傳統(tǒng)中醫(yī)記載的柴胡具有疏肝解郁功效一致[7-8]?，F(xiàn)代科學研究表明，SS對CCl4、脂多糖、卡介苗和D-氨基半乳糖誘導的急慢性肝損傷均有顯著的修復與保護作用[9]。

GPT 和GOT 可作為衡量肝損傷程度的指標，正常情況下在血液中含量極低，但在肝細胞受損時，肝細胞內(nèi)GPT 和GOT 因細胞膜受損釋放到血液中[10]。血清中SOD活性和MDA含量與肝細胞損傷程度呈正相關(guān)，通過檢測SOD 和MDA 的水平也可以反映出肝損傷的程度[11]。本研究結(jié)果顯示，肝損傷小鼠肝細胞病變明顯，肝索排列紊亂，細胞核溶解，同時血清轉(zhuǎn)氨酶GPT和GOT水平升高，出現(xiàn)明顯的氧化應激，表明小鼠肝功能受損，抗氧化能力明顯下降。本研究發(fā)現(xiàn)，SS-b2 能顯著降低血清轉(zhuǎn)氨酶活性和肝指數(shù)，明顯改善CCl4誘導的急性肝損傷的病理改變，升高肝損傷小鼠血清SOD 活性，同時降低MDA 的水平，減輕氧化應激反應對肝細胞的進一步損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是機體重要的細胞器，主導蛋白質(zhì)合成、翻譯與修飾、蛋白質(zhì)折疊等[12]。正常狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的PERK 與GRP78 蛋白結(jié)合，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，但是在急性肝損傷時，肝細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)會發(fā)生錯誤的折疊，不能被正常運出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而發(fā)生堆積，且錯誤折疊的蛋白質(zhì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上GRP78結(jié)合，會導致GRP78 與PERK 分離，激活PERK 通路，從而激活下游相應因子的表達，使細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子ATF4 表達增加并激活相應凋亡信號通路，導致細胞凋亡[13-14]。有研究報道，一些中藥成分可以抑制ERS 抗CCl4致肝損傷，例如番茄紅素可通過抑制GRP78和激活轉(zhuǎn)錄因子6蛋白的表達，同時抑制肌醇酶1-α和eIF2α的磷酸化水平來減輕CCl4誘導的小鼠急性肝損傷[15]；二至丸可通過抑制肝組織GRP78 和CHOP 蛋白的表達，發(fā)揮保肝護肝的作用[16]。這些中藥成分的原藥材并非傳統(tǒng)的護肝藥物，并且很多中藥成分都不是單體物質(zhì)，一般都具有多靶點，而SS-b2的原藥材柴胡本身就有疏肝解郁的作用，其作為一種單體藥物，闡明其確切的靶點在護肝藥物的開發(fā)中也有更大的意義。本研究結(jié)果顯示，SS-b2 可以下調(diào)急性肝損傷小鼠肝內(nèi)PERK，GRP78，p-eIF2α，ATF4 和CHOP 蛋白的表達水平，提示SS-b2 可能通過抑制ERS 信號通路發(fā)揮護肝作用。免疫組織化學染色結(jié)果也顯示，模型組PERK 蛋白在中央靜脈周圍強呈陽性表達，因為肝損傷后氧自由基和代謝產(chǎn)物大量聚積于中央靜脈，進一步加重了中央靜脈周圍肝細胞的損傷程度并誘發(fā)ERS 反應，使PERK 蛋白在此處聚集。SS-b2 可以通過下調(diào)PERK 蛋白表達水平，進而下調(diào)ERS 信號通路蛋白GRP78，p-eIF2α，ATF4 和CHOP表達，減輕氧化應激，發(fā)揮細胞保護作用。

綜上所述，本研究證實，中藥柴胡中活性單體成分SS-b2 對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用，其機制可能與改善氧化應激，下調(diào)ERS 信號通路PERK 蛋白表達有關(guān)。本研究為SS-b2 作為護肝藥物的研發(fā)提供了實驗基礎。