王 震，李玉蕾，周培嵐，蘇瑞斌，傅風(fēng)華

（1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺 264005；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850；3.抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

α2-腎上腺素能受體（alpha 2-adrenergic receptor，α2-AR）主要分布于突觸前膜，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)突觸前腎上腺素的釋放。α2-AR有3個(gè)亞型α2A-AR，α2B-AR和α2C-AR[1]，其中α2B-AR 主要分布于外周，如血管平滑肌和腎等，在中腦和丘腦也有少量分布，在血壓調(diào)控中具有重要作用[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，α2-AR通常與Gi/Go型G 蛋白偶聯(lián)[5-6]，受體激活以后可以抑制腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）-cAMP-蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）信號通路，進(jìn)而發(fā)揮其生理作用[4，7-8]。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，α2-AR 激活以后可以通過不依賴于AC的分子通路提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平[9]。由于目前尚無靶向α2-AR的亞型選擇性激動(dòng)劑，并且α2-AR 亞型選擇性拮抗劑特異性較差，在本實(shí)驗(yàn)室前期完成共表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）標(biāo)記的PKA催化亞基與α2A-AR 的CHO細(xì)胞株（CHOPKAcat-EGFP-α2A-AR 細(xì)胞）[10]的構(gòu)建后，亟需構(gòu)建一種表達(dá)α2B-AR的細(xì)胞模型，用于靶向α2-AR的激動(dòng)劑或者拮抗劑的快速篩選，為新藥研發(fā)和α2-AR后分子機(jī)制的研究提供支持。α2-AR 激活后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，胞內(nèi)Ca2+濃度增高可以激活鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM），從而激活活化T細(xì)胞核因子（nucleus factor of activated T cells，NFAT）信號通路，使NFATc1（即NFAT2）從細(xì)胞質(zhì)遷移到細(xì)胞核，發(fā)生核轉(zhuǎn)位[11-13]。以融合表達(dá)EGFP和NFAT2的U2OS 細(xì)胞（U2OS-EGFP-NFAT2）為工具細(xì)胞[14]，設(shè)計(jì)和構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)α2B-AR 和EGFP-NFAT2的細(xì)胞株（U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR），并選用α2-AR 激動(dòng)劑鹽酸右美托咪啶（dexmedetomidine hydrochloride，DMED）以及拮抗劑鹽酸阿替美唑（atipamezole hydrochloride，ATI）作用于細(xì)胞，結(jié)合NFATc1核轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)進(jìn)行受體功能活性的確證。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑、藥物和儀器

U2OS-EGFP-NFAT2 細(xì)胞由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所王莉莉研究員惠贈(zèng)；pCMV-SPORT6-α2B-AR 購自北京西美杰科技有限公司，重組質(zhì)粒構(gòu)建以及實(shí)時(shí)定量PCR所需引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；具有潮霉素B（hygromycin B，Hygro）抗性的PCDNA3.1 質(zhì)粒（pcDNA3.1-Hygro）由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所從玉文研究員惠贈(zèng)；Hind Ⅲ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RNA 酶抑制劑、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、2×Power SYBR Green PCR Master Mix、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、Hygro、Lipofectamine 2000、Hoechst33342核染色劑、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、蛋白梯度指示劑和PBS緩沖液（pH 7.4）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、dNTP混合物、Trizol RNA 提取液和Oligo dT18、D2000 DNA梯度指示劑購自北京天根生物技術(shù)公司；瓊脂粉購自上海Baygene生物科技有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒由美國Omega 公司購買；96 孔黑色透底檢測板購自美國Corning 公司；甲醛、無水乙醇、異丙醇、氨芐青霉素凍干粉和甲醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；兔抗人α2B-AR 單克隆抗體（EPR9623）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；小鼠抗人β 肌動(dòng)蛋白單克隆抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體和HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆IgG二抗購自北京普利萊基因技術(shù)公司。

蛋白酶抑制劑cocktail、RIPA 細(xì)胞裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、30%丙烯酰胺溶液、Tris（pH 8.8）1.5 mmol·L-1緩沖液、10%SDS、過硫酸銨、TEMED、Tris（pH 6.8）1.0 mmol·L-1緩沖液、10×TBST 緩沖液、10×PAGE 電泳緩沖液和蛋白印跡膜再生液Stripping 緩沖液購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；PVDF膜和化學(xué)發(fā)光的HRP 底物顯影液購自美國Millipore 公司；脫脂奶粉購自美國BD 公司；DMED 購自濟(jì)南德信佳生物科技有限公司；ATI S160801 由浙江海正藥業(yè)股份有限公司合成。Centrifuge 5424 R冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；7300 Real Time PCR system 和電泳槽購自美國Applied Bionsystem 公司；Envision 2104 多功能酶標(biāo)儀購自美國Perkin Elmer公司；PCR儀購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；水浴鍋購自北京長安科學(xué)儀器廠；GEL LOGIC 1500 成像系統(tǒng)購自美國KODAK 公司；DYY-8C 型電泳儀購自北京市六一儀器廠；CELL INSIGHT CX5高內(nèi)涵篩選平臺購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 pcDNA3.1-Hygro-α2B-AR重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以人源α2B-AR 基因CDS 序列為模板，設(shè)計(jì)含有Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的正向引物：CCCAAGCTTATGGACCACCAGG 以及含有XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的反向引物CCGCTCGAGATCACCAGGCCGT，通過PCR 法合成目的基因。反應(yīng)體系如下：10×PCR緩沖液5 μL，正向引物（20 μmol·L-1）2.0 μL，反向引物（20 μmol·L-1）2.0 μL，dNTP 混合物（2 mmol·L-1）2.0 μL，Taq DNA 聚合酶2.0 μL，pCMV-SPORT6-α2B-AR（50 mg·L-1）1 μL，H2O 36 μL；反應(yīng)過程如下：①94℃2 min，②94℃30 s，③65℃，30 s，④72℃60 s，⑤72℃10 min，其中過程②～④循環(huán)30 次。把PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后分離得到目的基因（1353 bp），用DNA 凝膠回收試劑盒將目的基因回收后，與pcDNA3.1-Hygro 質(zhì)粒分別經(jīng)Hind Ⅲ與XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切；酶切產(chǎn)物于16℃連接18～24 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)，接種到具有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取若干細(xì)胞單克隆，在擴(kuò)大培養(yǎng)以后提取重組質(zhì)粒；經(jīng)Hind Ⅲ與XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳pcDNA3.1-Hygro-α2B-AR，挑選具有目的基因條帶的菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，進(jìn)行目的基因的測序比對。

1.3 U2OS-EGFP-NFATc1-α2B-AR 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取pcDNA3.1-Hygro-α2B-AR 重組質(zhì)粒，按Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染方案轉(zhuǎn)染至U2OS-EGFP-NFATc1 細(xì)胞；24 h后換液，隨后用DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS和Hygro 200 mg·L-1）進(jìn)行抗生素壓力篩選；10 d后采用有限稀釋法挑取單克隆細(xì)胞并接種到96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，使用100 μL DMEM 培養(yǎng)基清洗細(xì)胞1次，空白對照組每孔加入200 μL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組先后各加入150 μL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含有50 μL DMED 的培養(yǎng)基，使DMED終濃度達(dá)到1.0×10-7mol·L-1；37℃孵育30 min，每孔加入12%甲醛100 μL，室溫固定20 min，使用PBS 緩沖液（pH 7.4）200 μL 沖洗細(xì)胞2 次，每孔加入100 μL用PBS 緩沖液配制的Hoechst33342 核染色劑1 μmol·L-1，室溫下避光反應(yīng)30 min，采用Thermo Scientific 公司的CELL INSIGHT CX5 高內(nèi)涵篩選平臺獲取細(xì)胞熒光圖像并分析，以單位細(xì)胞細(xì)胞核熒光顆粒熒光強(qiáng)度與單位細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)熒光顆粒熒光強(qiáng)度之比作為核轉(zhuǎn)位指數(shù)，則相對核轉(zhuǎn)位指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組核轉(zhuǎn)位指數(shù)-空白對照組核轉(zhuǎn)位指數(shù)；篩選核轉(zhuǎn)位指數(shù)最大的細(xì)胞株。

Z’因子法結(jié)合核轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)評價(jià)所選細(xì)胞模型的可靠性，計(jì)算公式為Z’=1-（3σc++3σc-）/｜μc+-μc-｜，σ：標(biāo)準(zhǔn)差，μ：平均值，c+：陽性對照組（使用1×10-7mol·L-1DMED處理）；c-：陰性對照組（溶劑處理組）。Z’因子在0.5～1時(shí)，表明細(xì)胞株功能比較穩(wěn)定。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）法檢測α2B-AR mRNA轉(zhuǎn)錄水平

將U2OS-EGFP-NFAT2 細(xì)胞和U2OS-EGFPNFAT2-α2B-AR 細(xì)胞分別接種到6 孔板，采用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，采用紫外分光光度法測定總RNA 的濃度。以RNA 為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，20 μL 的反應(yīng)體系如下：總RNA 1.0 μg，5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4.0 μL，dNTP 混合物（10 mmol·L-1）2.0 μL，RNA 酶抑制劑（20 U·μL-1）0.5 μL，Oligo dT18 引物（50 mmol·L-1）1.0 μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μL-1）：1.0 μL，其余體積用DEPC 處理水補(bǔ)足。反應(yīng)條件如下：42℃1 h，70℃5 min。設(shè)計(jì)qRT-PCR 反應(yīng)引物如下：α2B-AR 的正向引物：AGGTCAACGGACACTCGAAG，反向引物：CGGGTCCCAGTATCTTCAGG；GAPDH 的正向引物：AGGTCATCCCAGAGCTGAACG，反向引物：TCAGATGCCTGCTTCACCAC。以α2B-AR為目的基因，GAPDH為內(nèi)參基因，檢測α2B-AR mRNA相對含量。反應(yīng)體系如下：2×Power SYBR Green PCR Master Mix 5.0 μL，cDNA 0.6 μL，正向引物（10 μmol·L-1）0.2 μL，反向引物（10 μmol·L-1）0.2 μL，DEPC處理水4.0 μL。反應(yīng)過程如下：①95℃2 min，②95℃15 s，③62℃10 s，④70℃30 s，⑤72℃5 min，其中過程①進(jìn)行1 個(gè)循環(huán)，過程②~④進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，過程⑤進(jìn)行1 個(gè)循環(huán)。以公式2-△△Ct計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平[15]。

1.5 Western蛋白印跡法檢測α2B-AR蛋白的表達(dá)

U2OS-EGFP-NFAT2 細(xì)胞和U2OS-EGFPNFAT2-α2B-AR 細(xì)胞分別傳至20 mm 培養(yǎng)皿，待生長約至90%，使用含有蛋白酶抑制（1×cocktail）的RIPA細(xì)胞裂解液在4℃收取全蛋白，在旋轉(zhuǎn)搖床上裂解細(xì)胞30 min；4℃，13 000×g離心15 min，吸取上清液；采用BCA 法測定蛋白提取液的總蛋白濃度；加入相應(yīng)體積的上樣緩沖液后，于沸水中加熱變性5 min。

配制10%的分離膠5 mL，體系如下：1.9 mL水，1.7 mL 30%丙烯酰胺溶液，1.3 mL Tris（pH8.8）1.5 mmol·L-1，50 μL 10%SDS，50 μL 10%過硫酸銨，20 μL TEMED?？焖俚貙⒎蛛x膠溶液灌注到玻璃板間，并在溶液上層覆蓋1 mL的水。待凝膠聚合后，棄殘留水，加入1 mL 5%積層膠（積層膠體系如下：680 μL水，170 μL 30%丙烯酰胺混合液，130 μL Tris（pH 6.8）1.0 mmol·L-1，10 μL 10%SDS，10 μL 10%過硫酸銨，1 μL TEMED），并插入10孔梳，待積層膠完全聚合后，即可進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。配置SDS-PAGE凝膠電泳緩沖液，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，上樣量為20 μL，含10 μg總蛋白，分組為：U2OSEGFP- NFAT2- α2B- AR 細(xì) 胞 組、U2OS- EGFPNFAT2細(xì)胞組和蛋白梯度指示劑組，電泳條件：80 V，20 min，110 V，1.5 h。取下凝膠，裁剪適當(dāng)大小的PVDF膜和濾紙，在浸入電轉(zhuǎn)液的條件下，將凝膠覆蓋于兩層濾紙上，將PVBF膜放在膠面上，并再次覆蓋兩層濾紙，濾紙兩面用海綿夾住，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，關(guān)上轉(zhuǎn)移盒置轉(zhuǎn)移液槽中，加入適量轉(zhuǎn)移液并放入冰袋，在冰浴的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)，在160 mA電流條件下，轉(zhuǎn)膜1.5 h。

電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取下PVDF 膜，常溫下在5%脫脂奶粉中封閉1 h。TBST清洗PVDF膜，常溫下使用α2B-AR 單克隆抗體（1∶10 000）孵育5 h。清洗PVDF膜，使用HRP標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體（1∶3000）溶液常溫下孵育2 h。清洗PVDF膜，配置適量顯影液，于暗處滴加到PVBF膜上，使PVDF膜完全浸潤。立即轉(zhuǎn)移至顯影儀顯影。取已經(jīng)顯影的PVBF 膜，清洗過后，加入膜再生液，室溫孵育30 min，清洗掉膜再生液，先后使用β肌動(dòng)蛋白抗體（1∶3000）和相應(yīng)HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體（1∶3000）各孵育孵2 h，并顯影。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR 細(xì)胞受體活性評價(jià)

將U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR 接種到96 孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，選用非選擇性α2-AR激動(dòng)劑DMED及α2-AR拮抗劑ATI進(jìn)行核轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)評價(jià)U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR 細(xì)胞受體活性。實(shí)驗(yàn)分組及加樣方式如下：空白對照組，每孔加入200 μL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基；DMED處理組，每孔加入50 μL 不同濃度的DMED（終濃度分別為：5.6×10-12，1.7×10-11，5.1×10-11，1.5×10-10，4.6×10-10，1.4×10-9，4.1×10-9，1.2×10-8，3.7×10-8，1.0×10-7，3.3×10-7，1.0×10-6mol·L-1）；ATI處理組，每孔加入50 μL的DMED（終濃度為：1×10-7mol·L-1）和50 μL不同濃度的ATI（終濃度分別為：5.1×10-10，1.5×10-9，4.6×10-9，1.4×10-8，4.1×10-8，1.2×10-7，3.7×10-7，1.1×10-6，3.3×10-6，1.0×10-5mol·L-1），加入DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)足反應(yīng)體系至200 μL。后續(xù)操作同1.3，計(jì)算相對核轉(zhuǎn)位指數(shù)，繪制DMED 和ATI的量效曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建的pcDNA3.1-Hygro-α2B-AR重組質(zhì)粒

PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明，在1000～2000 bp 之間有一條明顯的條帶（圖1A），大小與目的基因（1353 bp）相吻合；PCR 產(chǎn)物膠回收后，用Hind Ⅲ與XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，與同樣雙酶切的pcDNA3.1-Hygro 質(zhì)粒進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，從接種的單克隆菌株提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物在約1300 bp 及＞2000 bp 處均呈現(xiàn)較亮條帶（圖1B），分別為目的基因及載體條帶。對重組質(zhì)粒測序，目的基因序列與α2B-AR基因（Gene ID：151）的CDS區(qū)序列一致，表明α2B-AR基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Fig.1 Verification of α2B-adrenoceptor（α2B-AR） by agarose gel electrophoresis.A：PCR product of α2B-adrenoceptor；B：recombinant plasmid pcDNA3.1-hygromycin B（Hygro）-α2B-AR digested by HindⅢand XhoⅠ. M：marker；Lane 1 was PCR product of α2B-AR（A）or pcDNA3.1-Hygro-α2B-AR digested by Hind Ⅲand XhoⅠ（B）.

2.2 構(gòu)建的U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

采用有限稀釋法培養(yǎng)經(jīng)Hygro 200 mg·L-1篩選的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，共得到13 株單克隆細(xì)胞U2OSEGFP-NFAT2-α2B-AR。采用核轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)篩選陽性細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)編號12的細(xì)胞株生長狀態(tài)良好并具有最高的活性，核轉(zhuǎn)位指數(shù)為0.445（圖2）。在不同傳代次數(shù)的3 次平行實(shí)驗(yàn)中，Z’因子分別為0.664，0.533和0.634，均在0.5～1之間，表明編號12細(xì)胞株功能穩(wěn)定，下一步對該細(xì)胞株進(jìn)行mRNA和蛋白水平的驗(yàn)證。

Fig.2 Screening of U2OS cells expressing enhanced green flourescent protein labeled nucleus factor of activated T cells 2（EGFP-NFAT2）and α2B-AR（U2OSEGFP-NFAT2-α2B-AR）cells by nucleus translocation assay.

2.3 U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞α2B-AR mRNA轉(zhuǎn)錄水平

U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR 細(xì) 胞 表 達(dá) 的α2B-AR mRNA 在第5，10，15 和20 代的水平與第1代相當(dāng)，且為對照細(xì)胞U2OS-EGFP-NFAT2的百倍以上（P<0.01）（圖3），表明α2B-AR mRNA在持續(xù)的傳代過程中穩(wěn)定表達(dá)。

Fig.3 Transcriptional levels ofα2B-AR in mRNA U2OSEGFP-NFAT2-α2B-AR cells.s，n=4. ＊＊P<0.01，compared with U2OS-EGFP-NFAT2 cells（control）by t test.

2.4 U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞α2B-AR蛋白表達(dá)水平

Western 蛋白印跡結(jié)果顯示，在分子質(zhì)量約45 ku 處，U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR 細(xì)胞（α2B組）中可檢測到明顯的目的條帶，而在U2OSEGFP-NFAT2 細(xì)胞（對照組）中未檢測此條帶（圖4），說明U2OS-EGFP-NFAT2 細(xì)胞無α2B-AR 蛋白表達(dá)，并且U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR 細(xì)胞株的α2B-AR蛋白在多次傳代后穩(wěn)定表達(dá)。

Fig.4 Expression of α2B-AR protein in U2OS-EGFPNFAT2-α2B-AR cells（α2B）and U2OS-EGFP-NFAT2 cells（control）by Western blotting.

2.5 U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR細(xì)胞受體活性

NFAT2核轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)檢測U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR細(xì)胞受體活性?？瞻讓φ战M細(xì)胞的相對核轉(zhuǎn)位指數(shù)為0，EGFP-NFAT2 綠色熒光蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈彌散性分布，胞核內(nèi)無熒光顆粒聚集；DMED 1.4×10-9mol·L-1處理后，細(xì)胞的相對核轉(zhuǎn)位指數(shù)增加到0.138，即可以觀察到EGFP-NFAT2綠色熒光顆粒聚集，但顆粒聚集程度不明顯；DMED 1.0×10-7mol·L-1處理后，細(xì)胞的相對核轉(zhuǎn)位指數(shù)增加到0.276，細(xì)胞核中可以觀察到明顯的EGFP-NFAT2綠色熒光顆粒聚集，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)的綠色熒光強(qiáng)度明顯降低；ATI 1.0×10-5mol·L-1處理后（與1.0×10-7mol·L-1DMED共孵育），EGFP-NFAT2綠色熒光蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈彌散分布，核內(nèi)無熒光顆粒聚集，DMED（1.0×10-7mol·L-1）對EGFPNFAT2 核轉(zhuǎn)位的促進(jìn)作用被完全拮抗（圖5A）。DMED在5.6×10-12～1.0×10-6mol·L-1濃度范圍內(nèi)，可以濃度依賴性地增強(qiáng)EGFP-NFAT2的核轉(zhuǎn)位，其半數(shù)有效濃度（EC50）為（2.616±0.121）nmol·L-1，DMED 的濃度達(dá)到3.7×10-8mol·L-1時(shí)，即達(dá)到最大效應(yīng)，此時(shí)相對核轉(zhuǎn)位指數(shù)約為0.445（圖5B）。

ATI在5.1×10-10～1.0×10-5mol·L-1濃度范圍內(nèi)，可以濃度依賴性地拮抗DMED的作用，半數(shù)抑制濃度（IC50）為（89.05±0.22）nmol·L-1（圖5C）；在ATI濃度達(dá)到3.7×10-7mol·L-1時(shí)，即可完全拮抗DMED的作用，此時(shí)相對核轉(zhuǎn)位指數(shù)約為0（圖5C）。U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR 細(xì)胞的編號12 號的細(xì)胞株受體活性良好，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

Fig.5 Receptor activity of U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR cells evaluated by nucleus translocation assay. A：fluorescent images. Arrows show NFAT2 translocated to nucleus. B and C：concentration-response curve of DMED（B）and ATI（C）in U2OS-EGFP-NFAT2-α2B-AR cells，respectively.，n=3.

3 討論

本研究以NTAT2的核轉(zhuǎn)位原理為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了可用于高內(nèi)涵篩選靶向α2B-AR 化合物的細(xì)胞模型。α2B-AR 激活以后，可以通過NFAT 信號通路使NFAT2 發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)位，通過核轉(zhuǎn)指數(shù)的變化，可以濃度依賴性地檢測化合物對α2B-AR的激活或者拮抗作用。

α2-AR 屬于G 蛋白偶聯(lián)受體，受體激活后可以升高人紅白血病細(xì)胞胞漿內(nèi)的Ca2+濃度[9]，胞內(nèi)鈣濃度的升高可能由G蛋白激活的磷脂酶C介導(dǎo)的，或者與G 蛋白偶聯(lián)的胞膜或者線粒體上的鈣通道的激活有關(guān)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，以本課題組構(gòu)建的α2A-AR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株為工具細(xì)胞，α2A-AR激活后胞內(nèi)Ca2+濃度的升高是由G 蛋白激活后βγ 亞基介導(dǎo)的磷脂酶C 激活引起的，并且Gαi亞基與Gβγ亞基具有相反的作用[16]，但是尚無研究明確α2B-AR激活后胞內(nèi)Ca2+濃度升高的機(jī)制及其相關(guān)的分子信號通路。本文構(gòu)建的α2B-AR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，結(jié)合高內(nèi)涵分析方法，提供了一種簡易快速地研究α2B-AR下游信號通路分子機(jī)制的新途徑，并可與課題組基于PKA重分布實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的α2A-AR和α2C-AR細(xì)胞株一起，共同用于靶向α2-AR化合物的篩選。

DMED 是一種α2-AR 激動(dòng)劑，對α2-AR 的3 種亞型無明顯選擇性，臨床上用于患者機(jī)械插管時(shí)的輔助鎮(zhèn)靜。臨床使用不當(dāng)時(shí)（如給藥速度過快，或者過量應(yīng)用），可能會(huì)產(chǎn)生心動(dòng)過緩、心律失常和血壓降低等副作用。鑒于α2B-AR 在外周的廣泛分布及與血壓調(diào)節(jié)的密切關(guān)系，推測這有可能與DMED對α2B-AR的激活有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，DMED的鎮(zhèn)靜作用主要由α2A-AR所介導(dǎo)[17]，推測DMED的毒副作用也可能是由特定亞型的α2-AR的所介導(dǎo)。以本文所建立的細(xì)胞模型為工具細(xì)胞，有助于DMED激活α2-AR后細(xì)胞內(nèi)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究，并為從受體水平闡釋DMED的藥效學(xué)和毒理學(xué)機(jī)制提供支持，還可應(yīng)用于靶向性好、毒性低的新藥研發(fā)。