李榮巧，李發(fā)珍，謝 童，范彥英，楊彩紅

（山西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，山西太原 030001）

多柔比星（doxorubicin，DOX）是高效廣譜的蒽醌類抗腫瘤抗生素，被廣泛應(yīng)用于多種血液系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤，如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌和胃癌等[1]，但其發(fā)揮抗腫瘤作用的同時會引發(fā)一系列的毒副反應(yīng)，如脫發(fā)、胃腸道反應(yīng)、心臟毒性和骨髓抑制，其中危害較為嚴重的是其心血管毒性。據(jù)統(tǒng)計，接受DOX 或其衍生物治療的患者中，大約10%患者在化療停止后10 年內(nèi)會相繼出現(xiàn)心臟并發(fā)癥[2]，大大降低了癌癥患者的遠期生活質(zhì)量及存活率。目前，DOX相關(guān)心血管毒性機制尚未完全清楚[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，DOX劑量依賴性慢性心肌病有顯著的血壓過低癥狀[4]。為探究其血壓降低的癥狀是否與藥物直接作用于血管相關(guān)，本研究擬探討DOX 對大鼠胸主動脈和頸總動脈血管環(huán)的作用及其可能機制，旨在豐富其藥理毒理學(xué)資料，減輕其毒副反應(yīng)，提高癌癥患者的遠期生活質(zhì)量和生存率。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

DOX（北京索萊寶科技有限公司）（批號427B023）；去氧腎上腺素（苯腎上腺素，phenylephrine，PE）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、左旋硝基精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester，LNAME）、吲哚美辛（indometacin，Indo）、四乙銨（tetraethylammonium，TEA）、4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）、氯化鋇（BaCl2）和格列本脲（glibenclamide，Gli）均購自美國Sigma；普萘洛爾（propranolol，產(chǎn)品批號為1802001）購自天津力生制藥股份有限公司；生理鹽溶液（physiological saline solution，PSS）成 分（mmol·L-1）：NaCl 144，KCl 5.8，CaCl22.5，MgCl21.2，葡萄糖11.1，HEPES 5；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。生物信號采集分析系統(tǒng)（型號PowerLab 8/30）及張力記錄儀（型號MLT0201/D）購自澳大利亞埃德公司；雷磁pH計（型號PHS-3E）購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；數(shù)字式超級恒溫浴鍋（型號HSS-1B）購自成都儀器廠。

1.2 動物和大鼠胸主動脈和頸總動脈血管環(huán)的制備及平衡[5-6]

SPF 級別SD 雄性大鼠，體質(zhì)量250～300 g，山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（晉）2009-0001。將SD大鼠處死后，迅速取出其胸主動脈及左右頸總動脈，置于充有純氧的4℃PSS液中，小心將其周圍結(jié)締組織剔除，剪3～4 mm 長的血管環(huán)為內(nèi)皮完整血管環(huán)，采用自制棉棒來回輕輕摩擦2次可得去內(nèi)皮血管環(huán)。將血管環(huán)管腔通過1個三角形掛鉤和1個L型細鋼絲貫穿，水平懸掛于10 mL 恒溫浴槽內(nèi)，下方固定，上方通過細鋼絲與張力換能器相連，用PowerLab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)檢測血管環(huán)張力變化。恒溫浴槽內(nèi)不斷通入100% O2，加入5 mL 37℃PSS 液，并保持溫度在36.8～37.2℃。主動脈和頸總動脈環(huán)懸掛于浴槽，分別調(diào)節(jié)前負荷為2 和1 g，穩(wěn)定約60 min，期間每隔15 min換PSS液1次。

KCl 60 mmol·L-1重復(fù)刺激2次，2次KCl收縮幅度差值<10%證明血管活性良好。PE 1 μmol·L-1收縮達穩(wěn)態(tài)時加入ACh 10 μmol·L-1，若胸主動脈舒張程度＞70%，說明內(nèi)皮完整性良好，為內(nèi)皮完整組。若其舒張程度<10%，則認為內(nèi)皮去除完全，為去內(nèi)皮組。若頸總動脈舒張程度＞30%，可認為血管組織結(jié)構(gòu)完整，可用于藥物干預(yù)實驗。

1.3 基礎(chǔ)狀態(tài)及KCl預(yù)收縮的胸主動脈和頸總動脈血管環(huán)張力測定

采用內(nèi)皮完整胸主動脈及頸總動脈血管環(huán)，分別分為溶劑對照組和DOX給藥組，在血管環(huán)基礎(chǔ)狀態(tài)下及KCl 60 mmol·L-1預(yù)收縮穩(wěn)定后每10 min累積加入DOX，使其終濃度遞增為1，3，10，30和100 μmol·L-1（以下累加DOX 均同此法）。溶劑對照組加入等體積生理鹽水，以排除滲透壓對血管環(huán)張力的影響。DOX 舒張血管百分比（%）=（KCI 誘發(fā)的血管環(huán)最大的收縮張力-給DOX 后血管環(huán)張力）/（KCI 誘發(fā)的血管環(huán)最大的收縮張力-血管環(huán)基礎(chǔ)張力）×100%。

1.4 PE 預(yù)收縮的胸主動脈和頸總動脈血管環(huán)張力測定

采用內(nèi)皮完整胸主動脈、頸總動脈和去內(nèi)皮胸主動脈，PE 1 μmol·L-1預(yù)收縮穩(wěn)定后，給藥組加入累積濃度DOX（加藥方法同1.3），溶劑對照組加入等體積溶劑，累積濃度DOX 舒張血管的百分比（%）=（PE 誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮張力-給DOX 后血管環(huán)張力）/（PE 誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮張力-血管環(huán)基礎(chǔ)張力）×100%。

1.5 L-NAME、吲哚美辛和普萘洛爾預(yù)處理后PE預(yù)收縮的胸主動脈血管環(huán)張力測定

L-NAME 0.1 mmol·L-1、Indo 0.01 mol·L-1和普萘洛爾0.01 mol·L-1孵育內(nèi)皮完整胸主動脈血管環(huán)30 min，PE 1 μmol·L-1預(yù)收縮達穩(wěn)態(tài)后加入累積濃度DOX（加藥方法同1.3），DOX組只加累積濃度DOX，求各組累積濃度DOX舒張血管的百分比，計算方法同1.4。

1.6 鉀通道阻滯劑預(yù)處理后PE預(yù)收縮的胸主動脈血管環(huán)張力測定

鉀離子通道阻滯劑BaCl21 mmol·L-1、TEA 1 mmol·L-1、Gli 0.01 mmol·L-1和4-AP 1 mmol·L-1孵育內(nèi)皮完整胸主動血管脈環(huán)30 min，之后實驗方法同1.5，求得各組累積濃度DOX 舒張血管的百分比。

1.7 DOX預(yù)處理后無鈣液中PE預(yù)收縮的胸主動脈血管環(huán)張力測定[7-8]

待胸主動脈血管環(huán)穩(wěn)定后，用含EGTA 的無鈣PSS 液洗脫血管環(huán)，以此絡(luò)合細胞外鈣，使細胞外液達到一種無鈣的理想狀態(tài)，20 min 后用不含EGTA 的無鈣PSS 液替換浴槽內(nèi)液體，排除EGTA對復(fù)鈣后血管收縮反應(yīng)的影響。15 min后加入PE 1 μmol·L-1，記錄胸主動脈血管環(huán)的張力變化，此時的血管收縮反應(yīng)是依賴于細胞內(nèi)鈣的釋放；待血管環(huán)收縮穩(wěn)定后，累積加入CaCl2（0.03，0.1，0.3，1 和3 mmol·L-1），此時血管的收縮是依賴于細胞外鈣的內(nèi)流。將2次血管收縮最大張力值作為給藥前對照值，當(dāng)血管環(huán)收縮達平臺后，用含EGTA 的無鈣PSS液洗脫血管環(huán)，20 min后用不含EGTA的無鈣PSS 液替換浴槽內(nèi)液體，分別預(yù)孵DOX 1，10 和100 μmol·L-1，對照組加入等體積溶劑，30 min后加入PE，血管收縮達平臺期后復(fù)鈣，比較預(yù)孵DOX前后PE引起的血管收縮幅度及復(fù)鈣后血管收縮幅度變化，觀察DOX對內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流引起胸主動脈血管環(huán)收縮的影響。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 及Graph Pad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，兩組間比較進行t 檢驗分析，P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DOX 對大鼠離體胸主動脈和頸總動脈血管環(huán)基礎(chǔ)張力的影響

實驗結(jié)果表明，累積濃度DOX對基礎(chǔ)狀態(tài)下的大鼠離體胸主動脈血管環(huán)（圖1A）和頸總動脈血管環(huán)（圖1B）無明顯的收縮和舒張作用。

Fig.1 Effect of doxorubicin（DOX）on basic tension of rat thoracic aorta（A）and carotid artery（B）.s，n=6.There was no significant difference between DOX and vehicle control groups.

2.2 DOX 對KCl 預(yù)收縮的大鼠離體胸主動脈和頸總動脈血管環(huán)的影響

累積濃度DOX 對KCl 預(yù)收縮的大鼠離體胸主動脈（圖2A）和頸總動脈血管環(huán)（圖2B）無明顯的收縮和舒張作用。

2.3 DOX對PE預(yù)收縮的頸總動脈血管環(huán)張力影響

累積濃度DOX 對PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整頸總動脈血管環(huán)有濃度依賴性的舒張作用，半舒張濃度（RC50）為30.47 μmol·L-1，最大累積濃度DOX 對血管環(huán)的舒張百分比為（72±8）%，與溶劑對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖3）。

Fig.3 Effect of DOX on rat carotid artery precontracted by phenylephrine（PE）1μmol·L-1. A：typical original tracting of endothelium-intact（End+）carotid artery after application of PE followed by cumulative application of DOX. B：relaxation was expressed as percentages of maximal contraction induced by PE. Relaxation rate（%）=（the maximal tension induced by PE-vascular tension after DOX）（/the maximal tension induced by PE-vascular basal tension）×100%.x±s，n=6.＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

2.4 DOX對PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮胸主動脈血管環(huán)的影響

累積濃度DOX 對PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整（圖4A、C）和去內(nèi)皮大鼠離體胸主動脈血管環(huán)（圖4B、D）均有濃度依賴性的舒張作用（r內(nèi)皮完整=0.95，P<0.01；r去內(nèi)皮=0.97，P<0.01）。最大累積濃度DOX 對內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮胸主動脈血管環(huán)的舒張率分別為（47±3）%和（27±4）%，內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01，圖4E）。

Fig.2 Effect of DOX on rat thoracic aorta（A）or carotid artery（B）precontracted by KCl 60 mmol·L-1 for 10 min. When vascular tension reached a stable state，DOX and saline were cumulatively added into organ bath.x±s，n=6.There was no significant difference between DOX and vehicle control groups.

Fig.4 Effect of DOX on endothelium-intact（End+）thoracic aorta（A，C）and endothelium-denuded（End-）thoracic aorta（B，D）precontracted by PE 1 μmol·L-1. A and B：typical original tracting of End+ thoracic aorta and Endthoracic aorta after application of PE followed by cumulative application of DOX，respectively. C，D and E：the quantitative results of A and B.，n= 6. ＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with corresponding vehicle control group；#P< 0.05，##P<0.01，compared with End-group.

2.5 L-NAME、吲哚美辛和普萘洛爾對PE預(yù)收縮下DOX舒血管作用的影響

PE 預(yù)收縮下，L-NAME 可明顯減弱DOX 的舒血管作用（P<0.01，圖5），說明DOX 的血管舒張效應(yīng)可能是通過內(nèi)皮途徑介導(dǎo)；普萘洛爾和環(huán)氧化酶抑制劑Indo 對DOX 的血管舒張效應(yīng)作用不明顯（圖5），表明DOX 的血管舒張作用可能與β 受體及前列環(huán)素?zé)o關(guān)。

Fig.5 Effect of NG-nitro-L-arginine methyl ester（L-NAME），indomethacin（lndo）and propranolol on DOX-mediated vasodilating effect on isolated thoracic aorta precontracted by PE 1μmol·L- 1. Thoracic aorta rings were incubated with L-NAME，Indo and propranolol for 30 min，then precontracted by PE. DOX was cumulatively added into organ bath.，n=6.＊＊P<0.01，compared with DOX group.

2.6 鉀通道阻斷劑對PE預(yù)收縮下DOX舒血管作用的影響

實驗結(jié)果表明（圖6），電壓依賴性鉀通道（KV）抑制劑4-AP、特異性鈣敏感性鉀通道（KCa）抑制劑TEA和內(nèi)向整流型鉀通道（KIR）抑制劑BaCl2可抑制PE 預(yù)收縮下DOX 引起的血管舒張（P<0.05，P<0.01），而ATP 敏感性鉀通道（KATP）抑制劑Gli 無此作用。說明DOX 對大鼠離體胸主動脈血管環(huán)的血管舒張效應(yīng)可能與Kv，KCa和KIR開放有關(guān)，而與KATP無關(guān)。

Fig.6 Effect of BaCl2，tetraethylammonium（TEA），glibenclamide（Gli）and 4-AP on DOX-mediated vasodilating effect on isolated thoracic aorta precontracted by PE 1μmol·L-1. Thoracic aorta rings were incubated with BaCl2，TEA，Gli and 4-AP for 30 min，then precontracted by PE. DOX was cumulatively added into organ baths，n=6.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with DOX group.

2.7 DOX 對依賴于內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流引起的血管收縮作用的影響

如圖7A，在無鈣PSS液中，PE 1 μmol·L-1可引起胸主動脈血管環(huán)小幅度的收縮，復(fù)鈣后進一步收縮。實驗結(jié)果表明，預(yù)孵DOX 1，10和100 μmol·L-1可濃度依賴性地抑制PE在無鈣液中引起的輕微血管收縮，收縮率分別為（55.5±3.1）%，（47.3±4.4）%和（37.2±2.0）%，與溶劑對照組（65.7±3.4）%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖7B）。預(yù)孵DOX 1，10 和100 μmol·L-1亦可濃度依賴性地抑制復(fù)鈣后的血管環(huán)收縮，使氯化鈣收縮曲線右移（P<0.05，P<0.01，圖7C）。

Fig.7 Effect of DOX on contraction of isolated thoracic aorta rings precontracted by PE 1 μmol·L-1 depending on intracellular calcium release and extracellular calcium influx. A：typical original tracting of the effects of giving prior DOX or not on PE-induced contractions. B：the second vasocontraction induced by PE was expressed as percentages of the first contraction induced by PE. C：the second vasocontraction induced by cumulative concentration of CaCl2 was expressed as percentages of the first maximal contraction induced by CaCl2. s，n=6.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，DOX 對PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整胸主動脈和頸總動脈血管環(huán)均有濃度依賴性的舒張作用，去除胸主動脈內(nèi)皮后，DOX 仍能部分舒張胸主動脈，但舒張作用減弱。因此，DOX 舒血管機制既有內(nèi)皮依賴性又有非內(nèi)皮依賴性。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是在內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxidase，eNOS）的作用下由左旋精氨酸轉(zhuǎn)化而成，可通過激活平滑肌細胞鳥苷酸環(huán)化酶，引起環(huán)鳥苷酸含量升高，使細胞內(nèi)鈣離子減少，進而介導(dǎo)血管平滑肌舒張[9]。本實驗預(yù)先給予eNOS抑制劑L-NAME，DOX的舒血管作用被部分抑制，說明其內(nèi)皮依賴性舒血管作用可能與內(nèi)皮-NO-cGMP途徑有關(guān)；前列環(huán)素是血管內(nèi)皮細胞合成的另一血管舒張因子，可通過激活腺苷酸環(huán)化酶，使細胞內(nèi)鈣離子含量降低進而引起血管舒張[10]。本研究中環(huán)氧化酶抑制劑Indo對DOX舒血管作用無明顯影響，而環(huán)氧化酶是合成前列環(huán)素的主要限速酶之一。由此推測，DOX的血管舒張作用與前列環(huán)素?zé)o關(guān)；另外，血管平滑肌細胞β腎上腺素能受體亦可使細胞內(nèi)Ca2+含量減少，從而舒張血管。本研究中，β受體阻斷劑普萘洛爾對DOX的血管舒張作用無影響，由此推測DOX的舒血管作用與β受體無關(guān)。

鉀離子通道是一類血管平滑肌細胞膜上調(diào)節(jié)平滑肌張力的重要離子通道，它的開放可引起細胞膜超極化進而關(guān)閉電壓門控性鈣通道，外鈣內(nèi)流減少導(dǎo)致血管舒張[11]。血管平滑肌細胞有4種不同類型的鉀通道[12]：①KV在血管平滑肌細胞廣泛存在，參與調(diào)節(jié)血管張力及血管平滑肌細胞的靜息電位；②KCa廣泛存在于生物體內(nèi)，在生理和病理條件下都有調(diào)節(jié)血管張力的作用；③KIR在多種細胞中均有表達，其調(diào)節(jié)血管張力作用目前尚不明確；④KATP可通過調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞膜靜息電位參與調(diào)節(jié)血管張力。阻斷這些通道后，通過觀察其對DOX舒血管作用的影響可初步判斷DOX 舒血管機制是否與鉀通道有關(guān)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KV抑制劑4-AP、KCa抑制劑TEA和KIR抑制劑BaCl2減弱了PE預(yù)收縮下DOX 的血管舒張作用，而KATP抑制劑Gli 對其無影響，說明DOX的血管舒張效應(yīng)可能與KV，KCa和KIR開放有關(guān)，與KATP無關(guān)。本研究僅對DOX舒血管機制與鉀通道的相關(guān)性進行了初步研究，仍需進一步的驗證與探討。

血管平滑肌收縮依賴于細胞外鈣內(nèi)流，亦可依賴于細胞內(nèi)儲鈣釋放[13]。KCl可通過激活電壓依賴性鈣離子通道（voltage dependent calcium channel，VDCC）引起細胞外鈣離子內(nèi)流，進而導(dǎo)致血管收縮。本實驗中，DOX對KCl預(yù)收縮下的大鼠胸主動脈和頸動脈血管環(huán)無作用，表明DOX可能不通過激活或抑制VDCC 而產(chǎn)生收縮或舒張血管的作用。PE 是α1腎上腺素能受體激動劑，一方面它可通過激動受體促進細胞外鈣內(nèi)流，另一方面，又可通過促進細胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣離子釋放，引起細胞內(nèi)鈣離子增多，共同促進血管收縮。本研究結(jié)果顯示，DOX可明顯抑制無鈣液中PE 誘導(dǎo)的血管收縮并可使CaCl2量效曲線右移，通過抑制外鈣內(nèi)流及內(nèi)鈣釋放發(fā)揮其舒血管作用。

綜上所述，DOX對靜息狀態(tài)及KCl預(yù)收縮的大鼠離體胸主動脈和頸動脈血管環(huán)張力無明顯影響，但可濃度依賴性地舒張PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整胸主動脈和頸總動脈血管環(huán)，且其對去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)也有舒張作用，但弱于內(nèi)皮完整組。DOX舒血管機制可能與內(nèi)皮細胞NO/cGMP 途徑、KV、KCa和KIR、內(nèi)鈣釋放及外鈣內(nèi)流有關(guān)，與前列環(huán)素、血管平滑肌β受體和KATP無關(guān)。