李海霞 夏正明 錢 坤 章漢旺 胡琳莉 夏 薇

1 廣州市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心(廣州 510180) 2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院西院區(qū) (廣州 510000) 3 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心 (武漢430030) 4 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 (鄭州 450000)

子宮內(nèi)膜容受性的形成是胚胎成功著床的一個重要的因素。有關(guān)子宮內(nèi)膜容受性的研究一直是國內(nèi)外廣大學(xué)者研究的熱點，其重要性尤其體現(xiàn)在輔助生殖領(lǐng)域。徐蓓[1]等通過原位雜交和RT-PCR技術(shù)在mRNA水平上檢測Meis1在人正常月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Meis1在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞均有表達(dá)，且在腺上皮細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度高于基質(zhì)細(xì)胞；Meis1在增生期表達(dá)較弱，分泌期顯著增加,其中分泌中期表達(dá)最強(qiáng)。Meis1的這一周期性表達(dá)，提示其可能受到體內(nèi)雌、孕激素的規(guī)律調(diào)控，從而對子宮內(nèi)膜容受性的形成和胚胎著床起重要作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot在蛋白水平上檢測受雌/孕激素干預(yù)后人子宮內(nèi)膜細(xì)胞中Meis1的表達(dá)，初步闡明其調(diào)控的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

用于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜取自因輸卵管或盆腔因素在本院行腹腔鏡手術(shù)的患者，月經(jīng)周期28～30天,年齡25～35歲,并排除子宮內(nèi)膜異位癥、生殖系統(tǒng)結(jié)核、宮腔粘連等疾病，且近3個月內(nèi)無激素服用史。

1.2 實驗方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(ESC)的分離和培養(yǎng)：將所取的子宮內(nèi)膜組織立即置于預(yù)冷的無菌PBS內(nèi)，送回實驗室，在超凈工作臺操作。組織用PBS洗三次后，用剪刀盡量剪碎，短暫離心后加入0.1% I型膠原酶37 ℃ 消化20～30min，400目篩網(wǎng)過濾，離心后加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12，按2×104/mL的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶和六孔培養(yǎng)板中，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)板孔內(nèi)放有已消毒的 20 mm 蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片，5天后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。每2天換培養(yǎng)液一次。(圖1A為原代培養(yǎng)的ESC，1B為免疫細(xì)胞化學(xué)顯示波形蛋白Vim染色為陽性)。

Ishikawa細(xì)胞復(fù)蘇后用含質(zhì)量濃度為100 g/L的FBS的DMEM/F12培養(yǎng)(圖1C為干預(yù)前Ishikawa細(xì)胞)。

1.2.2 雌、孕激素干預(yù)：待ESC和Ishikawa細(xì)胞形成致密單層時傳代。用PBS洗細(xì)胞2次，加0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮、變圓并有部分細(xì)胞脫落時即加入含血清培養(yǎng)基終止胰酶的消化作用，用吸管吹打壁上的細(xì)胞使其脫落、分離，以1:2比例接種于新培養(yǎng)瓶中，分別分為四組： E2組，P4組，E2+P4組及對照組(C組), 每兩天換培養(yǎng)液一次。待第三代細(xì)胞長至80%融合，觀察細(xì)胞狀態(tài)好時用含10%DCC-FBS的無酚紅DMEM/F12預(yù)處理24 h，實驗各組分別加入17-β雌二醇、MPA、17-β雌二醇+ MPA和無水乙醇進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)液為含質(zhì)量濃度為20 g/L的DCC-FBS的無酚紅DMEM/F12，干預(yù)時，17-β雌二醇和MPA終濃度10- 6M，C組給予同濃度的無水乙醇。干預(yù)時間48 h。本實驗所用細(xì)胞均為第三代細(xì)胞。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)：將上述各標(biāo)本用PBS(pH7.2～7.6)清洗3次，冰丙酮固定15min?？諝飧稍?min。再用PBS清洗標(biāo)本3次，質(zhì)量濃度為5 g/L的Triton X-100(PBS配制) 孵育20min。PBS清洗標(biāo)本3次，3%H2O2孵育15min。PBS清洗標(biāo)本3次，封閉血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液)20min。一抗孵育(PBS配，Meis1單克隆抗體滴度1:100，波形蛋白Vim單克隆抗體滴度1:400，濕盒)4 ℃過夜。陰性對照用PBS液。PBS清洗標(biāo)本3次，二抗工作液孵育(濕盒)37 ℃, 30min。PBS清洗標(biāo)本3次。C液(濕盒)37 ℃,30min。PBS清洗標(biāo)本3次。最后用DAB顯色，陽性顯色為棕黃色。蘇木素復(fù)染，自來水洗，封片后鏡下觀察。

1.2.4 Western blot： 提取細(xì)胞總蛋白： 將培養(yǎng)瓶(培養(yǎng)液倒掉)放于預(yù)冷0 ℃的平面上，用事先預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，吸凈培養(yǎng)瓶中殘留的PBS。取含有PMSF的三去污裂解液40 μL，加到培養(yǎng)瓶中，置于冰上15～20min。用細(xì)胞刮棒刮培養(yǎng)瓶細(xì)胞面，用吸管將細(xì)胞碎片及裂解液一起轉(zhuǎn)移到1 mL的EP管中。低溫離心機(jī)(4 ℃)12 000 g，離心5min。取上清提取細(xì)胞總蛋白。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度后，各組樣品(分別取50 μg蛋白，以質(zhì)量濃度為100 g/L的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分離蛋白，350 mA進(jìn)行恒流電轉(zhuǎn)移1 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF膜)上。再根據(jù)濾膜面積以0.1 mL/cm2的量加入含質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉的TBST(含0.1% Tween-20)封閉，室溫1 h。加入用5%脫脂奶粉的TBST稀釋的一抗，室溫振搖，與膜共同孵育1 h，然后4 ℃過夜(羊抗Meis1 單克隆抗體濃度為1:200，兔抗GAPDH 單克隆抗體濃度為1:500)。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，與膜共同孵育1 h，室溫振搖(兔抗羊多克隆抗體濃度為1:1000、羊抗兔多克隆抗體濃度為1:3000)，充分洗滌后采用ECL法顯影曝光。用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)對western blot目的條帶進(jìn)行光密度掃描，然后用Quantity One 軟件進(jìn)行分析，以Meis1/β-actin的相對光密度值表示結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 干預(yù)前ESC和Ishikawa細(xì)胞及ESC鑒定

2.1.1 原代培養(yǎng)的ESC及鑒定結(jié)果： ESC在接種后半小時開始貼壁，細(xì)胞呈梭形(圖1A)。波形蛋白(vitemin,Vim)是ESC的特異性標(biāo)記。采用免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，Vim染色呈陽性，陽性細(xì)胞的胞質(zhì)呈棕色，尤以核周色深，胞核不著色(圖1B)。

2.1.2 干預(yù)前Ishikawa細(xì)胞： Ishikawa細(xì)胞呈多角形，貼壁生長，見圖1C所示。

圖1 顯微鏡下干預(yù)前ESC和Ishikawa細(xì)胞形態(tài)及ESC鑒定(×100)A： 原代培養(yǎng)的ESC；B： 免疫細(xì)胞化學(xué)顯示波形蛋白(Vim)陽性；C： Ishikawa細(xì)胞

2.2 Meis1在ESC中的表達(dá)及調(diào)控

2.2.1 Meis1在ESC中的定位分析： 通過免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，Meis1表達(dá)在ESC的細(xì)胞核中，見圖2B所示。

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Meis1定位于ESC細(xì)胞核中A為培養(yǎng)的正常ESC，B為免疫細(xì)胞化學(xué)所示Meis1表達(dá)于ESC的細(xì)胞核中(SABC，400×)

2.2.2 在ESC中，雌、孕激素調(diào)控Meis1的表達(dá)： 分別提取E2, P4, E2+P4及C組的細(xì)胞蛋白行Western blot。結(jié)果顯示，E2、P4和 E2+P4三組中Meis1平均蛋白表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)。Meis1在E2、P4和 E2+P4組之間的表達(dá)水平亦有差異(P<0.05)，E2+P4組表達(dá)最高。以Meis1/β-actin灰度比值作為Meis1蛋白的相對表達(dá)值，其電泳圖譜和半定量分析結(jié)果見圖3：

圖3 雌、孕激素對Meis1在ESC中的表達(dá)影響E： 雌激素干預(yù)組 P： 孕激素干預(yù)組 E+P： 雌、孕激素聯(lián)合干預(yù)組 C： 對照組(*P<0.05，與對照相比；△P<0.05，與E組相比；#P<0.05，與E和P組相比)。

2.3 Meis1在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)及調(diào)控

2.3.1 Meis1在Ishikawa細(xì)胞中的定位分析： 通過免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，Meis1表達(dá)在Ishikawa細(xì)胞的細(xì)胞核中，見圖4B。

圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Meis1定位于Ishikawa細(xì)胞胞核中A為培養(yǎng)的正常Ishikawa細(xì)胞，B為免疫細(xì)胞化學(xué)所示Meis1表達(dá)于Ishikawa細(xì)胞的細(xì)胞核中(SABC，400×)

2.3.2 在Ishikawa細(xì)胞中，雌、孕激素調(diào)控Meis1的表達(dá)： 分別提取E2, P4, E2+P4及C組的細(xì)胞蛋白行western blot。E2、P4和 E2+P4均使Meis1表達(dá)增高，與對照組比較無差異(P>0.05)，E2、P4和 E2+P4各組間亦無差異(P>0.05)。以Meis1/β-actin灰度比值作為Meis1蛋白的相對表達(dá)值，其電泳圖譜和半定量分析結(jié)果見圖5所示：

圖5 雌、孕激素對Meis1在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)影響E： 雌激素干預(yù)組 P： 孕激素干預(yù)組 E+P： 雌、孕激素聯(lián)合干預(yù)組 C： 對照組

3 討 論

近年來，輔助生殖技術(shù)得到了日新月異的發(fā)展，但是著床率低下一直是阻礙其進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。胚胎著床是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，成功的著床須具備具有侵入性的胚胎和具有接受性的子宮內(nèi)膜。1976年法國的Psychoyos首次提出子宮內(nèi)膜容受性這一概念。子宮內(nèi)膜容受性，即母體子宮在某一特定的時期對胚胎植入的接受性。這一時期被稱為“著床窗口期”，在人類相當(dāng)于月經(jīng)周期的D20～24天，具有嚴(yán)格的時空特異性。在這一時期，子宮內(nèi)膜中一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交聯(lián)作用和著床相關(guān)基因的表達(dá)，形成分子級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，使子宮內(nèi)膜進(jìn)入“容受狀態(tài)”[2]。有關(guān)子宮內(nèi)膜容受性方面的研究一直是當(dāng)前研究的熱點。

研究證實[3]，在整個月經(jīng)周期中，HOXA10在ESC及腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)受卵巢雌激素和孕激素的規(guī)律調(diào)控，且在分泌中、晚期，HOXA10的表達(dá)明顯增強(qiáng)，雌激素和孕激素均能使HOXA10的表達(dá)增強(qiáng)，但孕激素的效應(yīng)更明顯，雌、孕激素聯(lián)合作用時, HOXA10的表達(dá)增強(qiáng)的效應(yīng)疊加。同時有研究也表明[4]，高水平的孕激素可通過結(jié)合孕激素受體后增強(qiáng)HOXA10的表達(dá)，從而在子宮內(nèi)膜ESC蛻膜化中發(fā)揮重要作用。提示H0XA10直接受雌、孕激素受體的調(diào)節(jié)。因此，H0XA10可能作為雌、孕激素作用的橋梁，通過對其下游著床相關(guān)基因的調(diào)控而介導(dǎo)對子宮內(nèi)膜分化及其功能調(diào)節(jié)[5]。研究證實[6]，在正常月經(jīng)周期中，分泌中、晚期的高水平雌、孕激素及HBEGF能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子HOXA10在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá),這與植入窗的開放時間一致,說明HOXA10基因在胚胎植入中起著重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，類泛素化HOXA10在反復(fù)著床失敗患者分泌中期子宮內(nèi)膜的異常高表達(dá)，而HOXA10基因的類泛素化影響了HOXA10的轉(zhuǎn)錄活性以及蛋白的穩(wěn)定性，這可能是影響胚胎著床的重要因素[7]。從反面進(jìn)一步說明了HOXA10在生殖中的作用。

Meis1作為HOXA10的輔因子，有關(guān)其在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)已有一些相關(guān)的報道，但具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。徐蓓[8]等通過宮腔內(nèi)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法降低圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜中Meis1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胚胎著床位點及胞飲突明顯減少，子宮內(nèi)膜容受性分子標(biāo)記物整合素β3表達(dá)也降低，可見Meis1在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)為胚胎成功著床所必需。本研究旨在通過研究ESC和Ishikawa細(xì)胞在體外受雌、孕激素干預(yù)后Meis1蛋白的表達(dá)水平，驗證Meis1受到雌、孕激素的規(guī)律調(diào)控，從而在子宮內(nèi)膜容受性的建立過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。本實驗所用Ishikawa細(xì)胞是一種高分化的子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系，具有雌、孕激素受體，因其具有與子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，是普遍用于研究子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞模型[9-10]。通過免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)，在ESC和Ishikawa細(xì)胞中，Meis1定位于細(xì)胞核中。分別用雌、孕激素干預(yù)后，通過western blot檢測各組細(xì)胞中Meis1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ESC中，雌激素和孕激素均能使Meis1表達(dá)增強(qiáng)，但孕激素增強(qiáng)的效應(yīng)更明顯，雌、孕激素聯(lián)合作用時使Meis1表達(dá)增強(qiáng)的效應(yīng)疊加，與HOXA10受雌、孕激素調(diào)控的模式一致；在Ishikawa細(xì)胞中，Meis1的表達(dá)在雌、孕激素作用下有增強(qiáng)趨勢。由此可見，轉(zhuǎn)錄因子Meis1可能與HOXA10結(jié)合形成異源二聚體，介導(dǎo)雌、孕激素的調(diào)控作用，影響HOXA10-DNA相互作用的親和力和特異性，從而影響下游靶著床相關(guān)基因的表達(dá)，繼而在構(gòu)建子宮內(nèi)膜容受性獨特的分子網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。