谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子基因的全基因組鑒定與分析

李雪垠，武懿茂，張鳳潔

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

谷子（Setaria italica）和狗尾草（Setaria viridis）都屬于禾本科狗尾草屬一年生草本植物，都是二倍體生物（2n＝18），谷子和狗尾草的基因組測序工作已于2012 年完成[1-2]。谷子，俗稱“小米”，是我國北方常見的雜糧作物[3]，小米不僅可食用，還可入藥[4]，是孕產(chǎn)婦和嬰幼兒的傳統(tǒng)營養(yǎng)佳品。近年來，隨著其營養(yǎng)價值和藥用價值逐漸被大眾所認(rèn)識，小米的市場需求呈增長趨勢，關(guān)于谷子的基礎(chǔ)研究也逐漸引起植物科學(xué)家的關(guān)注。狗尾草是田間極其常見的雜草，由于其具有基因組小、生長周期短、植株體積小等特點，具有模式生物所應(yīng)該具有的很多特征，所以，近年來越來越多的植物科學(xué)家將狗尾草當(dāng)作禾本科作物的模式生物來研究。

轉(zhuǎn)錄因子是植物中一類非常重要的調(diào)控蛋白質(zhì)，能夠調(diào)控植物的生長發(fā)育與逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)，其功能涉及植物發(fā)育的幾乎所有過程。植物轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定與分析是研究植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)與前提。WUSCHEL（WUS）-related homeobox（WOX）轉(zhuǎn)錄因子基因家族為植物所特有[5]，WOX 基因家族成員在植物的胚胎發(fā)育、干細(xì)胞維持和器官形成等關(guān)鍵發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[6]。WOX 轉(zhuǎn)錄因子都含有一個由60 個氨基酸組成的非常保守的DNA 結(jié)合同源結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD）[5]。同源結(jié)構(gòu)域?qū)τ赪OX 轉(zhuǎn)錄因子功能的發(fā)揮起著非常關(guān)鍵的作用[7]。

目前，隨著很多植物物種基因組測序工作的完成，植物中越來越多的WOX 基因家族成員已經(jīng)被鑒定。研究者從陸地棉、毛果楊、鷹嘴豆、小桐子、葡萄和毛竹基因組中已分別鑒定出37，18，17，12，10，5 個WOX 轉(zhuǎn)錄因子基因[5，8-11]。WOX 轉(zhuǎn)錄因子基因家族的鑒定與分析是進(jìn)一步研究WOX 基因功能和明確其在植物生長發(fā)育過程中作用的重要基礎(chǔ)。谷子和狗尾草作為禾本科狗尾草屬的2 種主要物種，其基礎(chǔ)和相關(guān)應(yīng)用研究已經(jīng)引起全球植物科學(xué)家的廣泛重視，但是截至目前，關(guān)于狗尾草屬WOX 基因家族的鑒定尚未見報道。

本研究擬對谷子和狗尾草2 種常見狗尾草屬植物物種的WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行全基因組鑒定，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)基序、順式作用調(diào)控元件和基因表達(dá)分析，以期為谷子和狗尾草WOX 家族基因的克隆和功能解析奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族基因鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

基于PlantTFDB V4.0 數(shù)據(jù)庫（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）[12]，鑒定谷子和狗尾草WOX 基因家族成員。谷子和狗尾草WOX 基因家族成員的編碼區(qū)和蛋白質(zhì)序列來源于Phytozome 數(shù)據(jù)庫（V12，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。 利 用ExPASy-Compute pI/Mw 工 具（https://web.expasy.org/compute_pi/），分析谷子和狗尾草WOX 基因的蛋白質(zhì)序列的等電點和分子質(zhì)量。

1.2 谷子和狗尾草WOX 基因系統(tǒng)發(fā)育及基因結(jié)構(gòu)分析

以Cluatal X2 軟件[13]對谷子和狗尾草WOX 基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對，并在MEGA 5.0 軟件[14]中以Neighbor-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap replications 數(shù)目設(shè)置為1 000）。以GSDS 2.0 工具（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[15]對谷子和狗尾草WOX 基因的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3 谷子和狗尾草WOX 基因的蛋白質(zhì)基序和順式作用調(diào)控元件分析

以Multiple Em for Motif Elicitation（MEME，Version 5.0.3，http://meme-suite.org/tools/meme）[16]工具鑒定谷子和狗尾草WOX 基因的蛋白質(zhì)基序。以PlantCARE（Plant Cis-Acting Regulatory Elements，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[17]工具鑒定谷子和狗尾草WOX 基因5′UTR 上游1.5 kb 啟動子區(qū)域內(nèi)的順式作用調(diào)控元件。

1.4 谷子和狗尾草WOX 基因組織特異與環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)分析

從Phytozome 數(shù)據(jù)庫中下載谷子和狗尾草WOX 基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，并在R 語言環(huán)境下以pheatmap 包分析上述基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并制作基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族基因鑒定與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

基于植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB，谷子基因組共有13 個WOX 轉(zhuǎn)錄因子基因，狗尾草基因組共有12 個WOX 轉(zhuǎn)錄因子基因。根據(jù)它們在谷子或狗尾草染色體上的定位情況，將其分別依次命名為SiWOX1～13 和SvWOX1～12。將這25 個WOX 基因的染色體定位、基因組位置、編碼區(qū)序列長度、蛋白質(zhì)序列長度、等電點和分子質(zhì)量等信息進(jìn)行整理（表1）。由表1 可知，谷子和狗尾草的WOX 基因分布在各自的2，3，5，6，7，8，9 號7 條染色體上，在谷子和狗尾草的1，4 號染色體上沒有發(fā)現(xiàn)WOX 基因，谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子基因的染色體分布情況很相似，這與谷子和狗尾草屬近緣物種的事實是一致的。而且WOX 基因在谷子和狗尾草的5 號染色體上分布最多，分別都有4 個WOX 基因。

2.2 谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)

谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1 所示。谷子和狗尾草各有13，12 個WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員。從圖1 可以看出，谷子和狗尾草的WOX基因在系統(tǒng)進(jìn)化樹中都是成對出現(xiàn)的，如SiWOX1/SvWOX1 等，每對基因（1 個SiWOX 和1 個SvWOX）親緣關(guān)系非常近，它們很可能是直系同源基因，即很可能產(chǎn)生于谷子和狗尾草物種分化前的同一個祖先基因，同時這也充分證明了谷子和狗尾草的親緣關(guān)系非常近，它們是狗尾草屬的2 個近緣物種。

從谷子和狗尾草WOX 基因結(jié)構(gòu)（圖1）可以看出，SiWOX/SvWOX 同源基因?qū)Φ幕蚪Y(jié)構(gòu)非常相近，即外顯子數(shù)目和外顯子長度很相似。另外，SiWOX 和SvWOX 基因的內(nèi)含子相位是0 或1，沒有相位為2 的內(nèi)含子。

表1 谷子和狗尾草WOX 基因基本信息及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

2.3 谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)基序

谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)基序分析結(jié)果如圖2 所示。谷子和狗尾草WOX 蛋白質(zhì)共有15 個基序，分別為Motif 1～Motif 15，其中，Motif 1，Motif 3 在谷子和狗尾草所有WOX 蛋白質(zhì)序列中都有分布，說明Motif 1，Motif 3 在所有蛋白質(zhì)基序中最為保守。Motif 4 和Motif 5 分別存在于18 個谷子和21 個狗尾草WOX 蛋白質(zhì)序列中，說明Motif 4 和Motif5 也相對較為保守。蛋白質(zhì)基序Motif 1，Motif 3，Motif 4 和Motif 5 的保守性可能與WOX 基因功能的正常發(fā)揮密切相關(guān)。谷子和狗尾草的直系同源基因?qū)Γㄈ鏢iWOX5/SvWOX5，SiWOX4/SvWOX4，SiWOX9/SvWOX9，SiWOX13/SvWOX12 等）不僅親緣關(guān)系較近（圖1），而且蛋白質(zhì)基序也很類似（圖2）。

2.4 谷子和狗尾草WOX 基因順式作用調(diào)控元件

WOX 轉(zhuǎn)錄因子與植物干細(xì)胞維持、胚胎發(fā)育和器官形成密切相關(guān)[6]，為了探究谷子和狗尾草WOX轉(zhuǎn)錄因子與植物生長發(fā)育的關(guān)系，本研究分析了谷子和狗尾草WOX 基因啟動子區(qū)域內(nèi)的順式作用調(diào)控元件，結(jié)果列于表2，3。值得注意的是，AACA_motif 和GCN4_motif 元件與胚乳發(fā)育有關(guān)，CAT-box元件與分生組織形成有關(guān)，RY-element 元件功能涉及種子發(fā)育（表3）。由表2 可知，SiWOX1，SiWOX4，SiWOX5，SiWOX12，SvWOX1，SvWOX4 和SvWOX5基因的啟動子至少包含上述2 種順式作用調(diào)控元件，說明這些基因作為WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，很可能與胚乳或種子發(fā)育、或分生組織形成密切相關(guān)。

表2 谷子和狗尾草WOX 基因啟動子順式作用調(diào)控元件

2.5 谷子和狗尾草WOX 基因在不同組織和不同環(huán)境誘導(dǎo)條件的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步探究谷子和狗尾草WOX 基因的功能，本研究分析了谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族21 個WOX 基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖3 所示。從圖3 可以看出，SiWOX6，SvWOX6，SiWOX11 和SvWOX10 在谷子根中表達(dá)量較高，在其他組織中表達(dá)量相對較低，尤其是SiWOX11 和SvWOX10 這2 個基因在光照處理10 d 的根組織中表達(dá)量非常高，說明這4 個基因可能參與調(diào)控根系的發(fā)育，這與先前WOX 基因與器官發(fā)育密切相關(guān)的研究結(jié)論[6]是一致的。另外，直系同源基因?qū)iWOX6 和SvWOX6 的基因表達(dá)模式也比較相似（圖3），這可能與二者啟動子區(qū)域順式作用調(diào)控元件的種類和數(shù)量比較相似（表2）有關(guān)。

表3 谷子和狗尾草WOX 基因啟動子順式作用調(diào)控元件核心序列及功能

3 結(jié)論與討論

狗尾草屬是一年生或多年生禾本科草本植物，主要包括谷子和狗尾草等。谷子耐旱、耐貧瘠，在過去一直被當(dāng)作主糧和救災(zāi)作物，后來由于產(chǎn)量過低，其主糧地位逐漸被水稻、小麥所取代，被歸為小雜糧一類，但是時至今日，小米仍然是我國北方重要的功能食品，是滋養(yǎng)腸胃和孕婦催奶的絕佳食品。近年來，谷子被當(dāng)作水分、氮磷養(yǎng)分高效利用研究的模式生物，又由于其屬C4 植物，所以，其也是研究C4 高效光合作用機制非常合適的植物物種。狗尾草是田間常見雜草，經(jīng)常困擾農(nóng)民朋友們，但是近年來發(fā)現(xiàn)其具有諸多模式生物所應(yīng)有的特點，其基礎(chǔ)研究逐漸引起植物學(xué)家們的關(guān)注。

植物轉(zhuǎn)錄因子種類和數(shù)量繁多，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長發(fā)育或脅迫應(yīng)答反應(yīng)等，其功能和作用機制非常復(fù)雜，其研究一直是植物領(lǐng)域的熱點。研究表明，WOX 轉(zhuǎn)錄因子主要參與調(diào)控植物器官發(fā)育、干細(xì)胞維持和胚胎發(fā)育等過程[6]。本研究鑒定了谷子和狗尾草的WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子基因親緣關(guān)系非常近，無論在基因結(jié)構(gòu)還是在蛋白質(zhì)基序上都具有極強的相似性，這與谷子和狗尾草是狗尾草屬近緣物種的事實是一致的，谷子和狗尾草物種分化的時間可能比較晚，所以，無論是在植株形態(tài)還是基因組序列上，都具有很強的相似性。

本研究中順式作用調(diào)控元件分析顯示，Si－WOX1，SiWOX4，SiWOX5，SiWOX12，SvWOX1，Sv－WOX4 和SvWOX5 基因的啟動子含有AACA_motif，CAT-box，GCN4_motif，RY-element 等元件，表明這些基因很可能與分生組織形成或胚乳、種子發(fā)育有關(guān)，其具體功能有待后續(xù)進(jìn)一步驗證。從本研究基因表達(dá)分析可以看出，SiWOX11 和SvWOX10 這2 個基因在根組織中表達(dá)量非常高，它們可能與根系發(fā)育密切相關(guān)。另外，直系同源基因盡管序列非常相似，但是其在特定組織中基因表達(dá)情況可能截然相反，比如直系同源基因SiWOX6 和SvWOX6 在幼苗中的表達(dá)量差異很大，其調(diào)控機制有待進(jìn)一步研究。本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定并分析了谷子和狗尾草WOX 轉(zhuǎn)錄因子家族基因，為后續(xù)狗尾草屬植物生長發(fā)育相關(guān)WOX 基因的克隆和功能研究奠定了理論基礎(chǔ)。