鄧曉瑜 張倩倩 侯鳳春 徐山山 張帆 于艷玲

隨著人們生活水平和美觀意識(shí)的不斷提高，成年人正畸治療需求量日益增加[1]。無(wú)托槽隱形矯治作為正畸學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)的一種新興的治療理念和技術(shù)，更順應(yīng)了人們追求美觀、舒適、健康的現(xiàn)代治療觀念[2-3]。Karkhanechi等[4]研究表明，隱形矯治技術(shù)不存在托槽，弓絲等復(fù)雜的裝置，口腔衛(wèi)生維護(hù)相對(duì)比較好，對(duì)牙周健康更具有優(yōu)勢(shì)。但是一體化覆蓋于牙面改變了齦上菌斑的生存環(huán)境，也可能對(duì)牙周健康存在一定程度的影響。所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)隱形矯治和固定矯治的牙周指數(shù)及牙周菌群的對(duì)比，探討兩種不同的矯治技術(shù)對(duì)牙周健康的影響是否存在差異。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

納入2017-06～2018-05青島市口腔醫(yī)院正畸科患者60 例。30 例固定矯治患者為A組，采用Gemini MBT金屬正畸托槽(3M， 美國(guó))，男性13 例，女性17 例， 平均年齡(25±5.3) 歲； 30 例無(wú)托槽隱形矯治患者為B組， 采用Invisalign隱形矯治器(Align Technology公司， 美國(guó))，男性16 例， 女性14 例，平均年齡(30±8.6) 歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者年齡18～35 歲；②下前牙無(wú)擁擠或輕度擁擠，正畸治療前均無(wú)齲齒或齲齒已充填；③牙齦色形質(zhì)正常，無(wú)附著喪失，正畸治療前均進(jìn)行齦上潔治術(shù)； ④所有受試者均進(jìn)行相同的口腔衛(wèi)生宣教，能?chē)?yán)格遵守早晚刷牙，刷牙時(shí)間不少于 5 min； ⑤無(wú)全身系統(tǒng)性疾病，女性患者非妊娠或哺乳期；實(shí)驗(yàn)前3 個(gè)月內(nèi)未服用激素或抗菌藥物；⑥經(jīng)患者本人同意試驗(yàn)且能按時(shí)復(fù)診者。

1.2 臨床牙周檢查

由同1 名接受過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的牙周醫(yī)師分別對(duì)治療前，治療3 個(gè)月，治療6 個(gè)月的牙周指數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)所有受試者的4 顆下頜中切牙，每顆牙3 個(gè)位點(diǎn)(包括近中頰點(diǎn)，正中位點(diǎn)，遠(yuǎn)中頰點(diǎn))共12 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢查，每個(gè)位點(diǎn)測(cè)量3 次取平均值，個(gè)人記數(shù)為12 個(gè)位點(diǎn)記數(shù)的平均值。檢測(cè)指標(biāo)包括牙齦菌斑指數(shù)(plaque index，PLI)，探診深度 (probing depth，PD)和牙齦指數(shù)(gingival index，GI)，方法參照《臨床牙周病學(xué)》第2版[5]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 齦溝液樣本的收集：每位受檢者復(fù)診前常規(guī)BASS法刷牙，棉卷隔濕，吹干牙面，將無(wú)菌紙尖伸入齦溝內(nèi)，插入至有阻力，靜置35 s后取出放入1.5 ml EP管中，加入1ml PBS溶液后保存在-20 ℃凍存，受血漬和唾液污染則棄之。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株及齦溝液 DNA提取 按照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行齦溝液樣品中細(xì)菌基因組DNA的提取。用超微量UV/可見(jiàn)光分光光度計(jì)對(duì)樣品濃度及純度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 首先根據(jù)牙齦卟啉單胞菌(NR_074234)(Porphyromonasgingivalis,Pg)、福賽坦氏菌(NR_074140)(Tannerellaforsythiain,Tf)16S rRNA序列的可變區(qū)設(shè)計(jì)其各自的特異引物，同時(shí)參考熒光假單胞菌、副溶血弧菌、大腸桿菌等細(xì)菌16S rRNA序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)細(xì)菌的通用引物。經(jīng)序列分析及預(yù)實(shí)驗(yàn)溶解曲線分析，引物具有良好的特異性，合成引物序列見(jiàn)表 1。

表 1 引物序列

其次，采用實(shí)用熒光定量PCR儀(ThermoFisher, Pikoreal96， 美國(guó))進(jìn)行定量檢測(cè)， 10 μl反應(yīng)體系包括2×的反應(yīng)預(yù)混液5 μl， 上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl， 模板1 μl， 水3.2 μl； 反應(yīng)程序： 95 ℃ 7 min； (95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 收集熒光信號(hào))40 個(gè)循環(huán)； 60 ℃ 30 s； 60～95 ℃(0.2 ℃/s)逐漸升溫收集溶解曲線熒光信號(hào)； 20 ℃ 10 s。

最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別將通用菌、Pg及Tf的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按10 倍梯度進(jìn)行系列稀釋?zhuān)鳛闊晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽(yáng)性模板。將標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以不同濃度陽(yáng)性模板的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)(Cq)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)樣品的Cq值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得其拷貝數(shù)。每個(gè)樣本檢測(cè)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。患者戴入矯治器前測(cè)量的數(shù)據(jù)作為基線，組內(nèi)比較臨床牙周指數(shù)、Pg和Tf構(gòu)成比在不同觀測(cè)點(diǎn)的變化，進(jìn)行方差分析及多重比較；組間對(duì)比不同時(shí)間點(diǎn)的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床牙周指數(shù)的檢查結(jié)果

治療前A組和B組的口腔衛(wèi)生良好，牙齦邊緣無(wú)明顯菌斑，牙齦健康，牙周探針深度小于2 mm， 2 組的牙周指數(shù)(PLI、 GI、 PD)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在治療3 個(gè)月， 2 組的下切牙近齦緣區(qū)可見(jiàn)不同程度的菌斑堆積，牙齦色澤的改變，牙周探診深度增加但小于2 mm， B組牙周指數(shù)在各個(gè)時(shí)期均低于實(shí)驗(yàn)A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 治療6 個(gè)月，A組的牙周指數(shù)持續(xù)上升， B組的部分牙周指數(shù)呈下降趨勢(shì)， B組的指數(shù)均低于A組，PD差異顯著性意義(P<0.01)(表 2～4)。

2.2 Pg和Tf的檢查結(jié)果

治療前， 組間對(duì)比Pg和Tf的構(gòu)成比， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 治療3 個(gè)月， B組的Pg構(gòu)成比低于實(shí)驗(yàn)A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Tf的構(gòu)成比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療6 個(gè)月，組間對(duì)比Pg和Tf的構(gòu)成比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表 2 T0期2 組牙周指數(shù)比較

表 3 T3期2 組牙周指數(shù)比較

表 4 T6期2 組牙周指數(shù)比較

組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比，A組的Pg的構(gòu)成比在治療3 個(gè)月達(dá)到高峰，隨著時(shí)間延長(zhǎng)在治療6 個(gè)月呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； B組的Pg的構(gòu)成比變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； A組和B組Tf的構(gòu)成比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表 5～6)。

3 討 論

對(duì)于正畸治療是否會(huì)造成牙周的損害一直存在較大爭(zhēng)議。Levrini等[6]認(rèn)為缺乏證據(jù)證明正畸治療會(huì)對(duì)牙周健康造成一定的影響，但是Harradine[7]表明固定矯治裝置會(huì)改變口腔微生態(tài)環(huán)境，增加牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)。Lu等[8]認(rèn)為隱形矯治比固定矯治更有利于維護(hù)牙周健康，牙齒更接近整體運(yùn)動(dòng)，可以防止齦上菌斑從牙齦轉(zhuǎn)移到齦下破壞牙周組織。本實(shí)驗(yàn)選擇兩組不同矯治器的患者，口腔衛(wèi)生狀況和依從性良好，排除青春期激素水平和各種社會(huì)環(huán)境等影響牙周健康的因素，以增加試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

表 5 Pg百分含量方差分析表

表 6 Tf百分含量方差分析表

牙菌斑生物膜是牙周病最主要的致病因素，菌斑的細(xì)菌及其產(chǎn)物是引發(fā)牙周病必不可少的始動(dòng)因子[9]。Pg是牙周炎病變區(qū)中最主要的優(yōu)勢(shì)菌群，Tf常在重度牙周炎附著喪失處的齦下菌斑中檢出，且與Pg存在著共生關(guān)系。隨著齦下菌斑中革蘭陰性厭氧菌種類(lèi)和數(shù)量的增多，機(jī)體免疫的抵抗與修復(fù)同細(xì)菌破環(huán)之間的平衡被打破，繼而出現(xiàn)牙齦炎癥，甚至向下破壞導(dǎo)致牙周附著喪失[10]。因此，對(duì)于細(xì)菌的檢測(cè)是非常有必要的[11]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是通過(guò)酶促反應(yīng)在體外擴(kuò)增特異DNA片段的一種技術(shù)方法，可直接用于菌斑、齦溝液、唾液或牙周組織樣本微生物的微量DNA檢測(cè)[12]，應(yīng)用敏感性和特異性高的DNA技術(shù),在超過(guò)1/3的個(gè)體中可檢測(cè)到Pg等牙周可疑致病菌[12-13]。而傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法研究低估了牙周致病菌的發(fā)生率， 限制了臨床的應(yīng)用[9]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，無(wú)論是固定矯治還是隱形矯治的牙周指數(shù)均隨著矯治的開(kāi)始而逐漸上升，到3 個(gè)月時(shí)達(dá)到高峰，并在之后的矯治中維持治療前的水平或略降低。Lindel等[14]研究表明初戴矯治器時(shí)，矯治器周?chē)鷷?huì)形成初始生物膜，宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，牙齒在受到持續(xù)力的作用下會(huì)發(fā)生一過(guò)性的牙齦炎癥，導(dǎo)致臨床牙周指數(shù)值升高。同時(shí)也可以看到A組的Pg的構(gòu)成比也在矯治3 個(gè)月達(dá)到高峰，之后呈下降趨勢(shì)。這說(shuō)明Pg的構(gòu)成比與牙周指數(shù)呈正相關(guān)。Kawada等[15]應(yīng)用定量PCR方法同樣也發(fā)現(xiàn)Pg數(shù)量隨牙周指數(shù)的升高而增加。從臨床試驗(yàn)觀察，固定矯治器等復(fù)雜裝置還是會(huì)影響牙齒的自潔，容易堆積菌斑，但是隨著每次復(fù)診口腔衛(wèi)生的深入指導(dǎo)， A組在第6 個(gè)月時(shí)，細(xì)菌的構(gòu)成比和牙周指數(shù)降低或維持穩(wěn)定。B組的Pg構(gòu)成比隨著時(shí)間延長(zhǎng)變化不顯著，在治療3個(gè)月呈略微降低趨勢(shì)，更加說(shuō)明隱形矯治可摘戴的方式有利于患者自潔，這也跟患者更加注重刷牙，使用牙線等維護(hù)口腔健康的方式有關(guān)。 2 組的Tf的構(gòu)成比變化不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，有研究表明Tf常常出現(xiàn)在嚴(yán)重的牙周炎患者中，說(shuō)明2 種矯治器在維護(hù)良好的口腔衛(wèi)生條件下并沒(méi)有對(duì)牙周組織造成不可逆的損害[16-17]。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了牙周致病菌的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種矯治方式在第6 個(gè)月和矯治前相比牙周狀況較穩(wěn)定，說(shuō)明牙周定植菌和宿主固有免疫之間達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，也可能由于牙齒排齊更有利于口腔衛(wèi)生的; 2 組患者在重視口腔衛(wèi)生的情況下，兩種矯治方式均能維持牙周的健康。從牙周指數(shù)及菌群變化看出，固定矯治器第3 個(gè)月達(dá)到高峰，隱形矯治變化不顯著，說(shuō)明隱形矯治更有利于口腔衛(wèi)生的維護(hù)。