李汪洋 劉鑫 李國(guó)明 全若琳 楊海嬌 李貴 魏華 張曉蓉
摘 要 通過(guò)超聲波輔助提取冬青葉總黃酮,構(gòu)建了鋁鹽雙波長(zhǎng)比色法檢測(cè)總黃酮模型,優(yōu)化了冬青葉總黃酮的測(cè)定方法,其測(cè)定波長(zhǎng)為510 nm,參比波長(zhǎng)為450 nm,在0.00~39.29 μg·mL-1時(shí)可用于測(cè)定冬青總黃酮,擬合的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.017X-0.000 8,R2=0.999 3。通過(guò)該方法測(cè)定冬青葉中總黃酮的含量為2.21%~2.55%(n=6)。鋁鹽雙波長(zhǎng)比色法可用于快捷簡(jiǎn)便地測(cè)定冬青葉中的總黃酮含量。
關(guān)鍵詞 冬青;總黃酮;含量測(cè)定;鋁鹽雙波長(zhǎng)比色法
中圖分類號(hào):R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.06.067
冬青(Ilex chinensis Sims)為冬青科Aquifoliaceae冬青屬I(mǎi)lex多年生植物,我國(guó)主產(chǎn)于安徽省、江西省、浙江省、兩湖兩廣等江南各省,一般生長(zhǎng)于海拔500~1 000 m
的山坡常綠闊葉林中和林緣地帶。冬青屬植物多用于清熱解毒、消炎、鎮(zhèn)咳祛痰及治療心血管疾病。冬青的根、種子、樹(shù)皮均可入藥,其葉有清熱利濕、消腫鎮(zhèn)痛之功效,用于肺炎、急性咽喉炎癥、痢疾、膽道感染、外治燒傷、下肢潰瘍、皮炎濕疹、腳手皮裂等[1-3]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,黃酮類是冬青主要活性成分之一,其具有明顯的降壓降脂、抗菌消炎及抗腫瘤等藥理功能。在對(duì)冬青葉中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定時(shí),發(fā)現(xiàn)其直接測(cè)定結(jié)果偏高;與文獻(xiàn)報(bào)道冬青葉總黃酮的含量存在較大差異(一般<3%)。基于此,擬采用雙波長(zhǎng)等方法對(duì)冬青葉中總黃酮含量測(cè)定體系進(jìn)行研究,以優(yōu)化和改進(jìn)總黃酮含量測(cè)定體系。
1 材料與方法
實(shí)驗(yàn)儀器主要有超純水制備系統(tǒng)(P20-Y,長(zhǎng)沙源科儀),電子天平(1/100 000,AG285,METTLE TOLEDO),紫外可見(jiàn)分光光度儀(UV2550,島津),超聲波提取器(昆山市超聲提取有限公司),萬(wàn)能高速粉碎機(jī)(天津市斯泰勒儀器有限公司)。實(shí)驗(yàn)試劑包括蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品(融禾公司生產(chǎn))及以下為分析純?cè)噭阂掖?、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。實(shí)驗(yàn)材料冬青葉于60 ℃恒溫干燥,粉碎,過(guò)70目篩,裝袋備用。
實(shí)驗(yàn)方法主要參考劉亞倩等[4-6]研究者進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備、冬青總黃酮供試品溶液的提取富集、總黃酮含量的檢測(cè)等步驟,并在此基礎(chǔ)上改進(jìn)冬青葉總黃酮檢測(cè)方法。具體步驟如下。
1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
準(zhǔn)確移取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、15.0 mL的0.2 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別置于50 mL比色管中,加1.50 mL5.0%亞硝酸鈉溶液,搖勻后靜置11 min,加入1.50 mL10.0%硝酸鋁溶液,搖勻,靜置12 min后加入10 mL4.0%氫氧化鈉溶液,搖勻,靜置20 min,于510 nm及參比波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定其吸光值,記錄下不同濃度吸光值。運(yùn)用Excel等軟件,以濃度為X軸,吸光值差值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.017X-0.000 8,Y吸光度,X為濃度,R2=0.999 3,在(0,39.29]μg·mL-1檢測(cè)范圍內(nèi)符合該方程
1.2 供試品溶液的制備
準(zhǔn)確稱取0.250 g冬青樣品于50 mL容量瓶中,用60%乙醇20 mL超聲提取30 min后取出定容,過(guò)濾,濾液即為待測(cè)供試品溶液。
1.3 總黃酮含量測(cè)定
移取10 mL待測(cè)供試品溶液于50 mL比色管中,加入10 mL去離子水,搖勻,加入1.5 mL5%的亞硝酸鈉,搖勻,靜置11 min,加入1.5 mL10%硝酸鋁,搖勻,靜置12 min后再加入10 mL4%氫氧化鈉溶液,搖勻靜置20 min后在510 nm及參比波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,根據(jù)差值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算總黃酮濃度然后進(jìn)一步計(jì)算總黃酮含量。計(jì)算公式:
式中,W為總黃酮含量(%),C為總黃酮濃度(μg·mL-1),V2為稀釋定容體積(mL),V1為取樣體積(mL),V0為提取液總體積(mL),M為供試樣品質(zhì)量(g),兩個(gè)1 000分別表示μg到mg及mg到g的換算系數(shù),100則表示100 g樣品中總黃酮的含量。
1.4 改進(jìn)樣品測(cè)定方法
樣品測(cè)定方法包括供試樣品溶液的全波長(zhǎng)掃描、篩選和建立雙波長(zhǎng)檢測(cè)模型及驗(yàn)證擬合檢測(cè)結(jié)果等。以下是操作步驟。1)供試樣品溶液的全波長(zhǎng)掃描。分別吸取之前備好的供試品溶液在比色皿中,潤(rùn)洗1~3次后加入比色皿中,利用紫外分光光度儀在檢測(cè)波長(zhǎng)510 nm和參比波長(zhǎng)450 nm處進(jìn)行測(cè)定并分別記錄下其吸光度。2)篩選和建立雙波長(zhǎng)檢測(cè)模型。通過(guò)全波長(zhǎng)掃描圖譜,分析其供試樣品的峰值及可能存在干擾的峰谷值,并通過(guò)△OD來(lái)篩選和建立雙波長(zhǎng)檢測(cè)模型。其中,△OD=OD510 nm-OD450 nm,通過(guò)扣除干擾,從而對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算。3)驗(yàn)證擬合檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)測(cè)定6份不同批次供試材料樣品,對(duì)擬合檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),初步驗(yàn)證和評(píng)價(jià)擬合模型的科學(xué)性程度。
2 結(jié)果與分析
經(jīng)過(guò)對(duì)各個(gè)供試樣品的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果進(jìn)行解析,發(fā)現(xiàn)其總黃酮掃描的峰值出現(xiàn)在(500±4)nm,而(450±4)nm處存在一峰谷值,與主峰OD500 nm的峰值存在明顯疊加。分析表明這種吸光值的疊加,極有可能是造成冬青總黃酮含量測(cè)定干擾的主因。經(jīng)過(guò)△OD(OD500 nm-OD450 nm)雙波長(zhǎng)擬合扣除干擾后,測(cè)定6份冬青葉供試材料的總黃酮含量,其總黃酮的含量最低為2.24%,最高為2.60%,6份樣本的平均值為2.21%~2.55%。
在課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),通過(guò)鋁鹽單波長(zhǎng)比色法測(cè)得冬青葉總黃酮含量高于文獻(xiàn)中報(bào)道(其總黃酮均低于3%)1倍以上,可能是冬青葉中的其他成分在總黃酮的檢測(cè)中,由吸光度疊加引起的。而通過(guò)△OD(OD500 nm-OD450 nm)雙波長(zhǎng)擬合扣除干擾后,能夠較好地測(cè)定冬青葉中總黃酮的含量,初步表明該雙波長(zhǎng)檢測(cè)方法適用于檢測(cè)冬青葉中的總黃酮含量[7]。
3 結(jié)語(yǔ)
冬青葉總黃酮測(cè)定中的雜質(zhì)消除、總黃酮中主要黃酮類物質(zhì)的提取工藝及高純度冬青葉中的黃酮類單體的制備也是后續(xù)研究工作的一部分。冬青葉中總黃酮測(cè)定的鋁鹽雙波長(zhǎng)比色法,實(shí)現(xiàn)了冬青葉中總黃酮含量的科學(xué)、快捷檢測(cè),為冬青葉中總黃酮資源的研究和開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)踐參考。
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