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      樹莓葉總黃酮的超聲波提取及純化前后抗氧化性研究

      2019-06-24 06:54余妍劉詠煌張青峰
      南方農(nóng)業(yè)·下旬 2019年2期
      關(guān)鍵詞:抗氧化性總黃酮

      余妍 劉詠煌 張青峰

      摘 要 目的:探討樹莓葉黃酮類物質(zhì)純化前后的抗氧化性比較。方法:采用超聲波最佳提取條件提取黃酮后,粗提液中黃酮物質(zhì)與經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后的提取液中黃酮物質(zhì)對DPPH自由基的清除率進(jìn)行比較。結(jié)果:超聲波提取后的紅樹莓粗提液中黃酮得率是5.227%,純化后的提取液中黃酮得率是11.419%。黑樹莓粗提液中黃酮得率為8.228%,純化后提取液黃酮得率提高到16.640%。樹莓葉黃酮純化前后抗氧化性存在較大差異,純化后抗氧化性增強(qiáng)。當(dāng)提取液濃度均為0.02 mg·mL-1時(shí),紅樹莓純化物對DPPH自由基的清除率增加23.36%,黑樹莓純化物對DPPH自由基清除率增加29.89%。結(jié)論:純化后的黃酮提取液隨著黃酮含量的增加抗氧化性增強(qiáng)。

      關(guān)鍵詞 樹莓葉;總黃酮;抗氧化性;DPPH自由基

      中圖分類號:TS255.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.06.068

      樹莓屬于薔薇科植物,又名木莓、托盤、馬林等,是多年生小灌木。在果樹分類學(xué)上屬漿果類樹莓屬(Rubus)果樹。根據(jù)果實(shí)成熟時(shí)的顏色,栽培上將樹莓分成黑樹莓、紅樹莓、黃樹莓、藍(lán)樹莓等。樹莓的果實(shí)、莖、根皆可入藥,具有很高的藥用價(jià)值,被稱之為“生命之果”[1]。樹莓黃酮是樹莓代謝工程中產(chǎn)生的一種重要的有機(jī)物,能夠預(yù)防心腦血管疾病,而且可以抑制癌細(xì)胞和提高記憶力[2]。

      樹莓葉中最常用的黃酮提取方法是有機(jī)溶劑提取[3],近年來超聲波提取技術(shù)越來越成熟,超聲波法原理主要是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈震動、高加速度、強(qiáng)烈空化效應(yīng)及攪拌作用等,加速植物有效成分進(jìn)入溶劑,從而有效提高黃酮化合物的獲得率,縮短提取時(shí)間,并且可免去高溫對活性成分的影響[4]。自由基性質(zhì)活潑,有很強(qiáng)的氧化能力,對人體易造成很大的傷害,與人體的許多疾病有著密切的聯(lián)系,黃酮類化合物具有很好的清除自由基能力。本研究以黑樹莓葉與紅樹莓葉為原料,采用超聲提取法最佳提取工藝,提取黃酮類化合物,以AB-8大孔樹脂作為吸附劑進(jìn)行純化。通過純化前后DPPH自由基的清除率反映其抗氧化能力的大小,為今后黃酮類物質(zhì)在實(shí)踐中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)性的研究。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      紅樹莓葉和黑樹莓葉購自南京金瑞藍(lán)莓專業(yè)合作社,洗凈瀝干后,50 ℃條件下烘干,粉碎成粗粉備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物有限公司);石油醚(天津市大茂化學(xué)試劑廠);DPPH自由基(上海源葉生物有限公司);無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鎂粉、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純。另外,還有MODEL722可見分光光度計(jì)(上海現(xiàn)科分光儀器有限公司)、電熱恒溫干燥箱和R20GB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海下豐實(shí)業(yè)有限公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 樹莓葉前處理

      將已粉碎的樹莓葉5.0 g用石油醚按料液比1∶20的比例用超聲波20 min進(jìn)行脫脂,然后抽濾,將抽濾后的樹莓葉放在桌面上自然風(fēng)干、備用。

      1.2.2 樣品提取液制備

      每次稱取干燥藥材份1 g于三角瓶中,萃取樹莓葉中的黃酮類成分,經(jīng)超聲提取后,抽濾,棄去固體殘?jiān)?,定容?0 mL,得黃酮粗提取液,備用。將脫脂的樹莓葉用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液按料液比1∶20超聲提取60 min,抽濾,收集濾液將其定容至100 mL容量瓶中,備用。

      1.2.3 定性檢測

      1.2.3.1鹽酸—鎂粉反應(yīng)

      分別準(zhǔn)確量取黃酮粗提取液和蘆丁溶液5 mL于試管中,加入少許鎂粉及鹽酸,搖勻,觀察反應(yīng)顏色。

      1.2.3.2與三氯化鋁的絡(luò)合反應(yīng)

      分別量取黃酮粗提取液和蘆丁溶液5 mL于試管中,加入1%三氯化鋁溶液,觀察顏色變化。

      1.2.3.3與NaOH的反應(yīng)

      分別取樹莓葉黃酮提取液與蘆丁溶液5 mL,加入1 mL 4%的NaOH溶液,輕輕混勻,觀察現(xiàn)象。

      1.2.3.4與濃硫酸的反應(yīng)

      分別取樹莓葉黃酮提取液與蘆丁溶液5 mL,加入1 mL濃硫酸,輕搖混勻,噴濾紙上吹干,觀察顏色變化,結(jié)果見表1。

      1.2.4 定量檢測

      采用蘆丁-分光光度法進(jìn)行定量檢測。

      1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

      準(zhǔn)確稱取在120 ℃條件下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg置于50.0 mL容量瓶中,約20.0 mL的無水乙醇溶解,再用30.0%的乙醇稀釋至刻度,配制成0.2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分別置于10.0 mL容量瓶中,各加入30.0%的乙醇5.0 mL,加入0.3 mL5.0%的NaNO2,搖勻后放置6 min,加入0.3 mL10.0%的Al(NO3)3,搖勻后再放置6 min,加入4.0%的NaOH溶液4.0 mL,分別用30.0%的乙醇定容,搖勻后放置15 min,以試劑空白作為參比,在510 nm處測吸光度A值。以濃度X(mg·mL-1)和吸光度A進(jìn)行回歸分析,得回歸方程為A=11.935c+0.0255,R2=0.999 3。

      1.2.4.2黃酮含量的測定

      1.2.5 黃酮粗提液抗氧化性分析

      1.2.6 黃酮純化及抗氧化的測定

      將大孔樹脂在乙醇中浸泡、攪拌24 h,然后倒入柱子中,靜置24 h,期間確保乙醇的液面高于大孔樹脂的液面。一次性完成裝柱,靜置24 h,上樣,靜置,靜吸附24 h,靜置期間避免與空氣接觸。先用蒸餾水進(jìn)行洗脫,洗至流出液無醇味為止,然后用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫,洗至流出液顏色接近無色為止,收集流出液,并將洗脫液旋蒸至盡量少的濃稠液,將純化后的提取液進(jìn)行抗氧化測定同2.5。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 定性實(shí)驗(yàn)

      由于黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有堿性氧原子和酚羥基,能與金屬類試劑如鉛鹽、鋁鹽、鐵鹽和鎂鹽等形成有色絡(luò)合物,由顏色反應(yīng)的結(jié)果可確定樹莓葉提取物中含有黃酮。結(jié)果見表1。

      2.2 純化前后兩種樹莓葉的黃酮得率比較

      兩種樹莓葉純化后的黃酮含量均有提高,黃樹莓得率從5.120%提高到11.381%,藍(lán)樹莓從9.517%提高到17.872%,結(jié)果見圖1。

      2.3 純化前后清除率比較

      2.3.1 紅樹莓葉純化前后對DPPH自由基的清除率

      用不同濃度的紅樹莓葉粗提液及純化后的樣品液對DPPH自由基進(jìn)行清除,紅樹莓葉黃酮提取物對DPPH自由基有很強(qiáng)的清除能力,且隨著黃酮含量的增加清除率增大。當(dāng)提取液黃酮濃度同為0.02 mg·mL-1時(shí),粗提物的清除率為59.92%,而純化物的清除率為83.28%。純化后的抗氧化能力明顯增加,結(jié)果見圖2。

      2.3.2 黑樹莓提取液純化前后對DPPH自由基的清除率

      黑樹莓葉黃酮提取物對DPPH自由基有很強(qiáng)的清除能力,且隨著黃酮含量的增加,清除率增大。當(dāng)提取液黃酮濃度同為0.02 mg·mL-1時(shí),粗提物的清除率為59.75%,而純化物的清除率為89.73%。純化后的抗氧化能力明顯增加,結(jié)果如圖3所示。

      3 討論

      本實(shí)驗(yàn)根據(jù)超聲波提取樹莓葉黃酮類物質(zhì)的最優(yōu)條件進(jìn)行黃酮提取,總黃酮提取液利用紫外分光光度計(jì)為200~600 nm時(shí),發(fā)現(xiàn)其最大吸收峰在510 nm處,與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在510 nm處有最大吸收一致,說明實(shí)驗(yàn)方法及過程基本正確。樹莓葉片中黃酮類化合物提取物對4種自由基(·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·)均表現(xiàn)出一定的清除能力,且清除能力和黃酮類化合物的含量有關(guān),含量越高,清除能力越強(qiáng)[5]。

      通過樹莓葉粗提液純化前與純化后的得率進(jìn)行比對可以看出,純化后的樹莓得率明顯高于純化前。樹莓葉純化物清除DPPH自由基的能力很強(qiáng),且隨著黃酮加入量的增加,清除率增大;與粗提物相比,當(dāng)清除率相同時(shí),純化物加入量比粗提物加入量明顯少,含有相同黃酮量時(shí),純化提取物清除DPPH自由基能力大于未純化提取物的清除能力,說明增大黃酮純度,清除DPPH自由基的能力也增大。由此提示樹莓葉黃酮提取后經(jīng)純化再利用具有更好的應(yīng)用前景。

      參考文獻(xiàn):

      [1] 馬曉麗.生物類黃酮的研究進(jìn)展[J].山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,15(5):70-73.

      [2] Huntley A L.The Health Benefits of Berry Flavonoids for Menopausal Women: Cardiovascular Disease, Cancer and Cognition[J].Malturitas,2009,63(4):297-301.

      [3] 趙瑞艷,徐雅琴.樹莓葉片中黃酮類物質(zhì)提取及抗氧化性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,22(2):104-106.

      [4] 黃瓊,黎貴卿,陳海燕,林翠梧.超聲波法提取牡荊總黃酮的工藝及其抗氧化性的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(6):2544-2545.

      [5] 楊國慧,張巖,于洋,等.樹莓葉果黃酮類化合物含量及抗氧化性分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,54(18):4514-4518.

      (責(zé)任編輯:劉昀)

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