曹暉 吳東升 張彧 陳大光

摘要：目的? 觀察芍藥湯對潰瘍性結(jié)腸炎（UC）大鼠結(jié)腸組織病理變化及免疫功能的影響，探究其對UC大鼠的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法? 采用TNBS誘導(dǎo)制作UC模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、美沙拉嗪組和芍藥湯組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)7 d。觀察大鼠一般狀況、體質(zhì)量、結(jié)腸組織大體形態(tài)、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分，HE染色觀察結(jié)腸組織病理變化，ELISA檢測血清白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-4含量，免疫組化檢測結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α、IL-4蛋白表達(dá)。結(jié)果? 與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.01），CMDI評分、血清和結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α含量和蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），IL-4含量和蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，芍藥湯組和美沙拉嗪組大鼠體質(zhì)量顯著升高（P<0.05），結(jié)腸組織一般形態(tài)和病理變化顯著改善，CMDI評分、血清和結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α含量和蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），IL-4含量和蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論? 芍藥湯能有效改善UC模型大鼠結(jié)腸組織一般狀況及病理變化，提高機(jī)體免疫功能，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)IL-1β、TNF-α及IL-4等細(xì)胞因子的含量和蛋白表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：芍藥湯;潰瘍性結(jié)腸炎;結(jié)腸病理變化;免疫功能;大鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）06-0059-05

Abstract： Objective To observe the effects of Shaoyao Decoction on colonic pathological changes and immune function in rats with ulcerative colitis （UC） induced by TNBS; To explore its immunoregulatory mechanism for UC rats. Methods A model of UC was induced using TNBS. SD rats were randomly divided into normal group， model group， mesalazine group and Shaoyao Decoction group. Each administration group was given relevant medicine for gavage for 7 d. The general condition， body weight change， gross morphology of colon tissue and CMDI score were observed. HE staining was used to detect pathological changes of colon tissue. Serum levels of IL-1β， TNF-α and IL-4 were detected by ELISA. Immunohistochemistry was performed to detect the expressions of IL-1β， TNF-α and IL-4 protein in colon tissue. Results Compared with the normal group group， body weight of the rats in model group significantly decreased （P<0.01）. The CMDI score， the contents and protein expressions of IL-1β and TNF-α in serum and colon tissue increased significantly （P<0.01）， and the content and protein expression of IL-4 decreased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， body weight of the rats in Shaoyao Decoction group and mesalazine group significantly increased （P<0.05）， and the general morphology and pathological changes of the colon

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種原因不明的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳易感性、上皮屏障缺陷、失調(diào)的免疫應(yīng)答和環(huán)境因素[1]，屬中醫(yī)學(xué)“久痢”“血痢”“腸風(fēng)下血”等范疇。芍藥湯出自劉完素《素問病機(jī)氣宜保命集》，其云本方之治法為“行血則便膿自愈，調(diào)氣則后重自除”，后世醫(yī)家皆推芍藥湯為治療濕熱痢疾之主方，多有較好的療效。鑒于辨病是辨證的前提，“方病對應(yīng)”是“方證對應(yīng)”和“病證結(jié)合”的基礎(chǔ)[2]，本實(shí)驗(yàn)觀察芍藥湯對UC大鼠結(jié)腸組織病理變化及免疫功能的影響，探究其對UC大鼠的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 動物

SPF級SD大鼠40 只，雌雄各半，體質(zhì)量150～170 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物房，溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.2? 藥物

芍藥湯（白芍30 g，黃芩15 g，黃連15 g，大黃9 g，檳榔6 g，木香6 g，當(dāng)歸15 g，肉桂5 g，炙甘草6 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房，經(jīng)水煮、濃縮、過濾，濃縮成2 mg原藥材/mL藥液，置于4 ℃冰箱保存。美沙拉嗪緩釋顆粒劑，上海愛的發(fā)制藥集團(tuán)，0.5 g/袋，批號20160316。

1.3? 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0105），10%水合氯醛（天津市凱信公司，批號20170328），TNBS（美國Sigma，批號3LBD6811V）;白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-4 ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號201803），兔抗鼠IL-1β、TNF-α、IL-4抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號BC025840、BC025786、BC025786），辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ZB2306）。酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），洗板機(jī)（芬蘭Thermo Labsystems），微量高速離心機(jī)（型號TG16W，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（型號GNP-9080，常州創(chuàng)威實(shí)驗(yàn)儀器廠），光學(xué)掃描顯微鏡（日本Olympus），2235型精密輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國LEICA）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 造模

參照文獻(xiàn)[3]方法制作UC模型。造模前大鼠禁食24 h，10%水合氯醛（4.0 mL/kg）腹腔注射麻醉，用石蠟油潤滑直徑0.4 mm軟管，插入直腸，深約8 cm，注入5%TNBS 50 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，再將大鼠提尾倒置60 s，使藥液充分停留結(jié)直腸內(nèi)。正常組給予等體積生理鹽水灌腸。清醒后自由飲水，造模后連續(xù)1周從體質(zhì)量變化、大便形狀、便血情況、內(nèi)臟敏感性、結(jié)腸病理等方面進(jìn)行模型評價。造模7 d后隨機(jī)抽取2只大鼠解剖，結(jié)腸病理顯示充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤、隱窩膿腫、杯狀細(xì)胞減少、腺體破壞及小潰瘍形成等一系列變化，提示造模成功[4]。

2.2? 分組和給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、美沙拉嗪組（0.067 g/kg）和芍藥湯組（1.800 g/kg），每組10只，雌雄各半。美沙拉嗪組和芍藥湯組于造模后7 d開始灌胃給藥，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，2 mL/次，連續(xù)7 d。各藥均以蒸餾水作溶劑配制，以60 kg成人每日服用藥物劑量與160 g大鼠體表面積換算比值換算出大鼠1 d用量，計(jì)算各給藥組臨床等效劑量[5]。

2.3? 標(biāo)本采集和檢測

末次給藥后禁食、禁水24 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4.0 mL/kg）麻醉，采血后脫頸處死大鼠，收集血液、結(jié)腸組織等進(jìn)行指標(biāo)檢測，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4? 一般觀察

自肛門處向上取結(jié)腸（8±2）cm，沿縱軸剪開，用生理鹽水沖洗干凈，并進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分。0分為無損傷;1分為輕度充血、水腫，無潰瘍;2分為腸壁變厚，無潰瘍;3分為有潰瘍（直徑<1 cm）;4分為有潰瘍（直徑>1 cm），腸管與周圍組織無粘連;5分為有潰瘍（直徑>1 cm），腸管與周圍組織有粘連[6]。

2.5? 結(jié)腸組織病理觀察

4%多聚甲醛固定結(jié)腸組織，經(jīng)脫鈣、脫水，石蠟包埋，切片（厚約4～5 μm），二甲苯脫蠟，無水乙醇水合，HE染色固定，鏡下觀察組織學(xué)變化。

2.6? 血清白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-4含量檢測

取大鼠抗凝全血，4 ℃、2500 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測。于酶標(biāo)儀波長450 nm處測定吸光度（A），根據(jù)待測樣品A值計(jì)算相應(yīng)IL-1β、TNF-α、IL-4的含量。

2.7? 結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-4蛋白表達(dá)檢測

取1 cm3大鼠結(jié)腸組織，4%多聚甲醛中固定30～60 min，PBS洗滌2次，50 ℃脫水，石蠟包埋，切片（厚約4 μm）。將所有樣品脫蠟、水合、滅活、抗原修復(fù)處理。5%牛血清白蛋白封閉切片20 min，再與一抗IL-1β（1∶500）、TNF-α（1∶500）、IL-4（1∶500）37 ℃溫育1 h，PBS洗滌，將切片與二抗羊抗兔IgG（1∶1000）于20～37 ℃溫育20 min，經(jīng)顯色、洗滌、脫水、透化、固定后，鏡下觀察。應(yīng)用Motic Advanced 6.0圖像分析系統(tǒng)分析。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，對樣本先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)，方差齊用LSD法進(jìn)行組間多重比較，方差不齊用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，用Kruskal-Wallis H test比較總差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 一般狀況

造模后1 d大鼠表現(xiàn)精神沉郁，毛發(fā)無光澤，聳毛，蜷縮，活動減少，并伴黏液便、血便及體質(zhì)量下降，造模大鼠有1～2只于造模后7 d內(nèi)死亡。與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，芍藥湯組和美沙拉嗪組體質(zhì)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與美沙拉嗪組比較，芍藥湯組大鼠體質(zhì)量無顯著變化（P>0.05）。見表1。

4.2? 結(jié)腸組織大體形態(tài)變化

模型組大鼠結(jié)腸肉眼可見明顯充血、水腫，伴見不同程度黏膜糜爛和潰瘍，潰瘍處腸內(nèi)容物嵌入，結(jié)腸病變處腸腔不同程度擴(kuò)張變形（見模型組A圖）;部分大鼠結(jié)腸表面有灰黑色偽膜，腸腔擴(kuò)張變形明顯，結(jié)腸與周圍組織粘連明顯，不易分離（見模型組B圖），嚴(yán)重者可出現(xiàn)大段結(jié)腸全層改變（見模型組C圖）;芍藥湯組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸與周圍組織粘連較輕，輕度充血、水腫，結(jié)腸黏膜輕度糜爛，腸腔內(nèi)潰瘍范圍小、數(shù)量少，且潰瘍呈愈合性表現(xiàn)。見圖1。

4.3? 芍藥湯對模型大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)的影響

4.4? 結(jié)腸組織病理變化

正常組大鼠結(jié)腸組織未見或少見炎性細(xì)胞浸潤;模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜明顯充血、水腫，廣泛炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞減少，潰瘍周圍腺體缺損且分布雜亂，腸壁廣泛纖維化，病變深達(dá)黏膜下層、肌層甚至漿膜層，可見炎性肉芽腫;芍藥湯組和美沙拉嗪組較模型組大鼠結(jié)腸病理改變明顯改善，表現(xiàn)輕度充血、水腫，炎性細(xì)胞浸潤減少，炎性細(xì)胞浸潤層次變淺，主要集中在黏膜層、黏膜下層，腸壁少量纖維化，部分結(jié)腸潰瘍周圍可見新生腺體，腸壁內(nèi)可見新生的杯狀細(xì)胞及腸黏膜層，呈愈合性改變。見圖3。

4.5? 芍藥湯對模型大鼠血清白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-4含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量顯著升高，IL-4含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，芍藥湯組和美沙拉嗪組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量顯著降低，IL-4含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與美沙拉嗪組比較，芍藥湯組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-4含量無顯著改變（P>0.05）。見圖4。

4.6? 芍藥湯對模型大鼠結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-4蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)顯著升高，IL-4蛋白表達(dá)顯著下降，（P<0.01）;與模型組比較，芍藥湯組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)顯著降低，IL-4蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）;與美沙拉嗪組比較，芍藥湯組大鼠結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α、IL-4蛋白表達(dá)無顯著改變（P>0.05）。見圖5～圖8。

5? 討論

臨床上，中醫(yī)治療UC有著獨(dú)特優(yōu)勢，《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》將芍藥湯確定為治療大腸濕熱證的主方[7]。

近年來，腸黏膜免疫功能紊亂在UC發(fā)病中的作用愈發(fā)受到重視，促炎細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子的失衡是腸黏膜免疫功能出現(xiàn)紊亂的重要原因[8-9]。促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-4的作用日益凸顯。IL-1β通過自分泌或旁分泌方式引起TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生，使局部組織出現(xiàn)急性炎癥，進(jìn)而引起結(jié)腸組織充血、水腫、潰瘍和壞死等病變[9];而IL-4不僅能抑制炎癥的發(fā)生、發(fā)展，還有一定的免疫抑制功能，故在維持腸黏膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中至關(guān)重要[10]。UC患者血清中IL-1β、IL-4、TNF-α含量可作為評估UC患者病情及預(yù)后的重要指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，TNBS造模后，模型組大鼠一般狀況及體質(zhì)量明顯下降，CMDI評分明顯升高，結(jié)腸組織出現(xiàn)不同程度的病理損傷，該變化符合UC改變，芍藥湯能不同程度提升UC大鼠的一般狀況和體質(zhì)量，降低CMDI評分，改善結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)及病理損傷，作用與美沙拉嗪無明顯差異，提示芍藥湯能顯著改善UC大鼠的一般形態(tài)變化及病理損傷;另外，造模后大鼠血清及結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α水平升高，IL-4水平降低，給予芍藥湯干預(yù)，大鼠血清及結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α的含量和蛋白表達(dá)顯著降低，IL-4含量和蛋白表達(dá)顯著升高，效果與美沙拉嗪相當(dāng)，提示芍藥湯改善機(jī)體免疫功能可能與調(diào)節(jié)IL-1β、TNF-α及IL-4等細(xì)胞因子的含量和蛋白表達(dá)相關(guān)，進(jìn)而減輕結(jié)腸組織損傷。

綜上所述，芍藥湯能顯著改善TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸組織一般形態(tài)及病理變化，并通過影響細(xì)胞因子的表達(dá)水平，發(fā)揮對機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。鑒于芍藥湯臨床應(yīng)用廣泛，深入探究芍藥湯治療UC的機(jī)制將為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-12-04）

（修回日期：2019-01-11;編輯：華強(qiáng)）