張紅波 李前瓊 呂雪鳳
【摘要】目的:建立靈芝養(yǎng)肝丸質量標準。方法:采用顯微鑒別法對豬苓、大黃、赤芍、黃連、厚樸、甘草進行鑒別,用薄層色譜法對大黃、黃連進行鑒別;用高效液相色譜法測定赤芍中芍藥苷的含量。結果:薄層色譜斑點清晰;芍藥苷在0.06~1.8μg(r=0.9999)的范圍內線性關系良好,平均回收率為98.41%(n=6),RSD為0.63%。方法精密度,重復性符合要求。結論:該方法結果準確可靠,適用于靈芝養(yǎng)肝丸的質量控制。
【關鍵詞】靈芝養(yǎng)肝丸;薄層色譜法;高效液相色譜法;質量控制
【中圖分類號】R284【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517(2019)8-0054-04
Abstract:ObjectiveToestablishthequalitystandardofGanodermalucidumliverpill.MethodsLingling,rhubarb,radixpaeoniae,Huanglian,Magnoliaandlicoricewereidentifiedbymicroscopicidentification,andrhubarbandHuanglianwereidentifiedbyTLC,andthecontentofPaeoniflorininRadixpaeoniaewasdeterminedbyhighperformanceliquidchromatography.ResultsTLCspotswereclear,thelinearrelationshipbetweenPaeoniflorinwasgoodintherangeof0.06~1.8μg(r=0.9999),theaveragerecoveryratewas97.98%(n=6),andtheRSDwas1.86%.MethodPrecision,repeatabilitymeettherequirements.ConclusionTheresultsofthismethodareaccurateandreliable,anditissuitableforthequalitycontrolofGanodermalucidumliverpill.
Keywords:GanodermaLucidumLiverPill;TLC;HighPerformanceLiquidChromatography;QualityControl
靈芝養(yǎng)肝丸為萊蕪市中醫(yī)醫(yī)院制劑品種,具有疏肝利膽、行氣化濕的功效,適用于脂肪肝、乙肝、膽系感染等癥。靈芝養(yǎng)肝丸由17味藥組成,組方復雜,原批準的質量標準較簡單,達不到控制質量的目的。為了更好的控制藥品質量,增加了對組方中豬苓、大黃、赤芍、黃連、厚樸、甘草的顯微鑒別,大黃、黃連的薄層色譜鑒別和高效液相色譜法測定赤芍中芍藥苷的含量,從而較全面的反應包括投料在內的質量控制指標。
1儀器與材料
1.1儀器ShimadzuLC-20A高效液相色譜處理系統(tǒng)(日本);梅特勒-托利多XS105DU電子分析天平(瑞士);科哲生化薄層色譜成像系統(tǒng);KQ-250DE超聲波清洗器;BX-51奧林巴斯顯微鏡。
1.2材料靈芝養(yǎng)肝丸(批號:180524、180607、180620,萊蕪市中醫(yī)醫(yī)院);大黃(批號:120902-201311);黃連(批號:120913-201611);芍藥苷(批號:110736-201842)對照藥材與對照品均為中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純。
2方法與結果
2.1顯微情況取本品適量,用水溶散,取沉淀物共裝10個載玻片置顯微鏡下觀察:菌絲散在或黏結成團,無色或淡棕色,細長,稍彎曲,有分枝(靈芝)。菌絲間有草酸鈣方晶,大多呈正方八面體形等(豬苓)。草酸鈣簇晶大,直徑60~140μm(大黃)。導管群放射狀排列,導管旁有木纖維(赤芍)。石細胞鮮黃色,單個或成群散在(黃連)。石細胞分支狀,壁厚,層紋明顯(厚樸)。纖維束周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶,形成晶纖維(甘草)。如圖1~7所示。
2.2薄層鑒別
2.2.1大黃的TLC鑒別取本品0.6g,加甲醇20mL,浸漬1h,濾過,取濾液5mL,蒸干,殘渣加水5mL溶解,再加鹽酸0.5mL,置水浴上加熱30min,立即冷卻,用乙醚20mL,分2次(10mL、10mL)振搖提取,合并乙醚提取液,蒸干,殘渣加三氯甲烷1mL使溶解,作為供試品溶液。再取大黃對照藥材0.1g,同法制成對照藥材溶液。另取處方中除去大黃的其他藥味,按處方比例制成缺大黃的陰性對照樣品。取陰性對照樣品2g,同供試品溶液的制法,制成陰性對照溶液。分別取上述3種溶液各4μL,分別點在硅膠G薄層板上,石油醚(30~60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同的5個橙色熒光斑點;置氨蒸氣中熏后,日光下檢視,顯相同的紅色斑點。陰性對照在相應位置沒有斑點,表明陰性對照無干擾。如圖8~9所示。
2.2.2黃連的TLC鑒別本品1g剪碎,加甲醇5mL,超聲處理15min,濾過,濾液作為供試品溶液。再取黃連對照藥材0.25g,同法制成對照藥材溶液。另取處方中除去黃連的其他藥味,按處方比例制成缺黃連的陰性對照樣品。取陰性對照樣品2g,同供試品溶液的制法,制成陰性對照溶液。分別取上述三種溶液各2μL。分別點在硅膠G薄層板上,甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水(6∶3∶1.5∶2∶0.3)為展開劑,在另槽中加入等體積的濃氨試液,預平衡15min,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照在相應位置沒有斑點,表明陰性對照無干擾。如圖10所示。
2.3含量測定
2.3.1色譜的條件C18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86);速度:1.0mL/min;檢測波長:230nm;進樣量:10μL。理論板數按芍藥苷峰計算應不低于3000。
2.3.2制備對照品溶液取芍藥苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1mL含60μg的溶液,即得。
2.3.3制備供試品溶液取本品10丸,剪碎,稱取5g,精密稱定,加入等量硅藻土,研細,置具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇50mL,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30min,取出,放冷,再稱定重量,用稀乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.3.4制備陰性對照溶液按處方比例制成不加赤芍藥材的陰性樣品,按照供試品溶液方法2.3.3制成陰性對照溶液。
2.4方法學的考察
2.4.1線性范圍分別精密吸取濃度為0.06mg/mL的芍藥苷溶液各2、5、10、15、20、30μL,注入液相色譜儀,分別測定峰面積積分值。以對照品的進樣量為橫坐標,對照品峰面積積分值為縱坐標,進行線性回歸,得回歸方程:y=88224x-8993.3,相關系數r=0.9999。試驗結果表明,芍藥苷進樣量在0.06~1.8μg之間進樣量與峰面積積分值呈良好的線性關系。
2.4.2儀器精密度試驗精密吸取芍藥苷對照品溶液(0.06mg/mL)5μL,注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,測其峰面積積分值。結果RSD為0.19%,表明儀器精密度良好。
2.4.3樣品穩(wěn)定性試驗取樣品(180524)照上述方法實驗。每隔5h進樣1次,每次5μL,測定芍藥苷的峰面積積分值,共5次,結果RSD為0.50%,表明供試品溶液在25h內穩(wěn)定性良好。
2.4.4方法重復性考察取同一批號(批號:180607)的樣品6份,按2.3.3項下方法制備供試品溶液,按2.3.1項下色譜條件進行測定,計算含量與RSD,結果表明,靈芝養(yǎng)肝丸供試品中芍藥苷的含量為0.93mg/g。RSD為1.89%,表明含量測定方法的重復性良好。
2.4.5加樣回收率試驗取已測知含量的本品適量(批號:180607,芍藥苷的含量為0.93mg/g),剪碎,取約2.5g,精密稱定,加入等量硅藻土,研細,置具塞錐形瓶中,精密加入芍藥苷對照品溶液(濃度為:0.06mg/ml)40mL、甲醇10mL,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30min,取出,放冷,再稱定重量,用稀乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5μL,注入液相色譜儀,測定,計算。結果表明,測定方法的回收率良好。見表1。
2.4.6專屬性試驗將對照品溶液、樣品溶液及陰性對照溶液,依次進行測定,按照“2.3.1”設定的色譜條件進行實驗。圖譜表明:陰性對照無相應色譜峰,可認為在此方法下該樣品中其他組成部分對實驗沒有影響。結果如圖11~13所示。
2.5樣品測定取3批樣品,按“2.3.3”項下方法得到的樣品溶液,按照預設的條件進行實驗,根據所得的峰面積得到樣品中芍藥苷的含量。結果見表2。
3討論
實驗參考藥典方法[1],分別采用顯微鑒別法對豬苓、大黃、赤芍、黃連、厚樸、甘草進行鑒別,各品種特征明顯可見。用高效液相色譜法測定赤芍中芍藥苷的含量,參考相關文獻[6-9],采用高效液相色譜法測定了赤芍中芍藥苷的含量??疾炝税步輦?200、島津LC-20A兩種儀器和InertsilODS-3(4.6mm×150mm,5μm);Agilent5TC-C18(4.6mm×150mm,5m);AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×150mm,5μm)3種色譜柱的影響。兩種儀器和上述3種柱子由計算所得可知實驗耐用性滿足要求,該方法操作簡便,樣品中芍藥苷峰與雜質峰完全分離,分析時間短,重現性良好。
根據相關資料[2-5],進行大黃、黃連的薄層色譜法適用性試驗,考察了不同的溫濕度(16℃、26℃,32%、65%、88%)和薄層板(Merck、青島海洋、煙臺大學科工所、自制板),均得到了滿意結果。該方法適用于靈芝養(yǎng)肝丸的測定。
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(收稿日期:2019-02-11編輯:陶希睿)